Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

Summary

Questo protocollo video mostra l'applicazione del test neurosfere per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali da eminenze gangliari del giorno embrionale 14-topo cervello.

Abstract

In mammiferi, le cellule staminali agisce come una fonte di cellule indifferenziate per mantenere la genesi e il rinnovamento cellulare in vari tessuti ed organi durante la vita dell'animale. Essi possono potenzialmente sostituire le cellule che si perdono nel processo di invecchiamento o in via di infortuni e malattie. L'esistenza di cellule staminali neurali (NSC) è stato descritto da Reynolds e Weiss (1992) negli adulti dei mammiferi sistema nervoso centrale (SNC) utilizzando un siero privo di sistema di coltura romanzo, il saggio neurosfere (NSA). Da questo test, è anche possibile isolare ed espandere NSCs provenienti da diverse regioni del SNC embrionale. Queste NSCs espanse in vitro sono multipotenti e possono dar luogo a tre tipi principali di cellule del sistema nervoso centrale. Mentre la NSA sembra relativamente semplice da eseguire, l'attenzione alle procedure dimostrato qui è necessario per ottenere risultati affidabili e coerenti. Questo video dimostra praticamente NSA per generare ed espandere NSCs fin dal primo giorno embrionale 14-topo tessuto cerebrale e fornisce dettagli tecnici così si può raggiungere culture neurosfere riproducibile. La procedura prevede la raccolta E14 embrioni di topo, microdissezione cervello per raccogliere le eminenze gangliari, dissociazione dei tessuti raccolti in NSC medio per ottenere una sospensione singola cellula e, infine, placcatura cellule in coltura NSA. Dopo 5-7 giorni di cultura, la risultante neurosfere primarie sono diversi passaggi di espandere ulteriormente il numero delle NSCs per gli esperimenti futuri.

Protocol

1. Impostazione di base prima di procedere alla dissezione:

1. Volume appropriato di completo media NSC è preparata mescolando NeuroCult medio basale NSC e NeuroCult NSC Supplementi proliferazione con un rapporto 9:1, rispettivamente.
2. Il mezzo è riscaldato in un bagno d'acqua a 37 ° C.
3. Freddo HEPES-buffered medio minimo indispensabile (HEM), con elevata concentrazione di antibiotici (10%) è preparato per la dissezione e lo scopo di lavaggio. In alternativa, media NSC basale con l'integrazione di antibiotici può essere usato anche per questo scopo.
4. 25-30 ml di HEM freddo contenenti antibiotici è erogato in sterili 50 ml provette per la raccolta degli embrioni.
5. Diversi 10 centimetri di plastica piastre di Petri necessario a contenere gli embrioni e il cervello durante la dissezione e anche per tenere il tessuto sezionato.
6. Gli strumenti chirurgici, necessari per eliminare gli embrioni (forbici grandi, piccole forbici a punta, pinze grandi, piccole pinze curve) o per la dissezione del cervello embrionale (pinze piccolo, curvo pinza sottile, 45 ° angolo una pinza sottile, e forbicine) vengono sterilizzati con perle di vetro sterilizzatore a 250 ° C o altri metodi di autoclave disponibili.
7. Microscopio a dissezione è pulito con alcool al 70% e impostare all'interno di una cappa a flusso laminare o PC2.

2. La raccolta E14 cervello di topo e Micro-dissezione:

1. Una volta accoppiato il mouse incinta è anestetizzato al giorno 14 ^° di gestazione secondo il proprio protocollo istituzionale animali approvati.
2. Dislocazione cervicale viene eseguita per assicurarsi che l'animale non soffre il dolore e angoscia.
3. Il mouse anestetizzato è posto sulla sua schiena su una carta velina assorbente, e l'addome è sciacquato con etanolo al 70% per sterilizzare la zona.
4. La pelle sopra l'addome viene afferrata con una pinza di grandi dimensioni, e poi la pelle e la fascia sottostante è tagliato con le forbici di grandi dimensioni per esporre la cavità addominale e le corna uterine.
5. Cervice vengono rimossi con una pinza e forbici piccole e vengono trasferiti in una da 50 ml tubo contenente HEM freddo.
6. I tessuti uterino vengono trasferiti al cofano e poi sciacquate con una o due volte il volume abbastanza fresca HEM sterile fredda per rimuovere possibili contaminanti come il sangue e capelli.
7. I tessuti uterino vengono poi trasferiti su un piatto da 10 centimetri di Petri contenente HEM freddo.
8. Le corna uterine vengono aperti utilizzando piccole pinze e forbici curve e gli embrioni vengono trasferiti in un piatto di 10 centimetri nuova, che contiene HEM freddo.
9. Le teste degli embrioni sono separati a livello cervicale del midollo spinale e trasferito in un altro piastra Petri contenente HEM freddo.
10. La piastra Petri viene trasferita sotto un microscopio da dissezione per rimuovere il cervello dal cranio.
11. Le teste sono tenute con una pinza sottile curva dal lato caudale così come il lato dorsale delle teste sono rivolte verso l'alto. Utilizzando micro-forbici, prima un taglio orizzontale è fatto sopra gli occhi per poi proseguire sulla linea mediana dalla fronte verso la parte posteriore della testa. Assicurati di tagliare attraverso la pelle e il cranio e non danneggiare il cervello sottostante.
12. Il cervello è rimosso dal cranio premendo i bordi della sezione di taglio con un movimento all'indietro con le pinze curve. Questa procedura è continuata fino a quando tutti i cervelli vengono rimossi dal teschi.
13. Il cervello è tenuta ferma con le pinze curve in modo che il lato dorsale è rivolto verso l'alto e quindi utilizzando microscissors viene eseguito un taglio attraverso la corteccia di ciascun emisfero si estende dal bulbo olfattivo alla parte posteriore dell'emisfero per esporre le eminenze gangliari.
14. Utilizzando la pinza curva in una mano e il 45 ° angolo forcipe nell'altra, i lembi taglio di cortecce sono sparsi e le eminenze gangliari vengono sezionati fuori.
15. Il tessuto sezionato viene inserito in una capsula di Petri sterile 10 centimetri, e questa procedura viene ripetuta fino a quando tutti i cervelli sono stati micro-sezionato.
16. Pezzi di tessuto sono raccolti con 1 ml di medium NSC in una pipetta da 1 ml di punta e trasferito in una provetta da centrifuga da 15 mL.
17. Tessuto è poi dissociato accuratamente, ma delicatamente, premendo la punta della pipetta sul fondo della provetta e pipettaggio la sospensione su e giù. In questo modo le macchie sono suddivisi in singole cellule. Pipettaggio viene eseguita 3-4 volte in modo che una sospensione lattiginosa come si ottiene. Poi, la sospensione è lasciata riposare per 1-2 minuti in modo da non dissociati grumi precipitati.
18. Quasi la sospensione cellulare viene trasferita l'intera al tubo di altri e poi un altro 1 ml di medium NSC viene aggiunto al grumi rimasti e dissociato di singola cellula come descritto.
19. Il contenuto dei tubi sono raggruppati e centrifugato per 5 minuti a temperatura ambiente, a 700rpm (110g).
20. Il supernatante viene aspirata giù per l'attuale pellet, e le cellule sono risospese in 1 ml di medium completo NSC.
21. Il mezzo è delicatamente pipettati su e giù peravere una sospensione omogenea singola cella.
22. 10 ml di sospensione cellulare viene miscelato con 90 ml di trypan blu per eseguire una conta cellulare.
23. Infine, le cellule sono placcati alla densità di 2x10 ⁵ cellule / ml in piena medio NSC integrato con 20ng / mL di fattore di crescita epidermico (EGF). 5 ml di mezzo è usato per T25, 20 ml per il T75 e T175 40 ml per fiaschi.
24. Neurosfere si formano in 5-7 giorni se posti in incubazione a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO _2. In 6-7 giorni, le sfere dovrebbe misurare tra 150-200 micron e sarà pronto per sottocultura (passaggio).

3. Passaging ed espansione di NSCs embrionali:

1. Quando le neurosfere sono pronti per la subcultura (150-200 micron di diametro), il mezzo con sfere sospese viene rimossa dal fiaschi, collocati in un apposito tubo di tessuto sterile cultura dimensioni, e centrifugati a 700 giri (110 g) per 5 minuti a a temperatura ambiente.
2. Il supernatante viene scartato e le sfere sono risospesi in 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA.
3. La sospensione cellulare viene quindi incubato in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2-3 minuti, poi un uguale volume di inibitore della tripsina di soia viene utilizzata per interrompere l'attività tripsina.
4. La sospensione cellulare viene delicatamente pipettato su e giù per assicurare che la tripsina è stato completamente inattivato.
5. La sospensione cellulare viene centrifugata a 700 rpm (110g) per 5 min. Poi, il sopranatante viene rimosso e le cellule sono risospese in 1 ml di medium completo NSC.
6. 10 ml di sospensione cellulare viene miscelato con 90 ml di trypan blu per eseguire una conta cellulare.
7. Le cellule sono placcati in una concentrazione di 5x10 ⁴ cellule / ml in totale medio NSC integrato con 20ng / mL di EGF in un apposito pallone di colture di tessuti dimensioni. 5 ml di mezzo è usato per T25, 20 ml per il T75 e T175 40 ml per fiaschi.
8. Neurosfere secondarie si formano in 5-7 giorni se posti in incubazione a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO _2.

4. Rappresentante dei risultati:

Nella scuola primaria la cultura embrionale NSC, la maggior parte delle cellule diventa ipertrofica e allegare ai piatti della cultura del tessuto su placcatura. Mentre la maggior parte delle cellule muoiono o differenziare, dopo 2-3 giorni, le cellule proliferative fare piccoli gruppi di cellule che si staccano dal substrato (Figura 1). Formazione di grandi aggregati sferoidali nelle prime 48 ore di cultura non deve essere confuso con sfere primarie. Formazione di aggregati dipende principalmente dalla quantità di detriti e non dissociata grumi di tessuto nella cultura. Neurosfere vero fase sono luminose e diventano più sferiche l'aumento delle dimensioni (Figura 2). Microspikes piccolo appare sulla superficie esterna di sfere vitali e sani (Figura 3). Dopo 5-7 giorni, le sfere devono essere rotonda, ma non compattato, e dovrebbe misurare tra 150 e 200 micron di diametro. Se neurosfere sono autorizzati a crescere troppo grandi (dopo 9-10 giorni in coltura), potrebbero formare aggregati o diventare di colore scuro a causa della morte delle cellule al centro delle sfere (vedi video). Neurosfere di grandi dimensioni potrebbe finalmente cominciare a differenziare in situ (allegando al substrato e la migrazione verso la periferia). E 'anche difficile dissociare neurosfere di grandi dimensioni e sottocultura loro.

Figura 1. Primaria E14 cultura NSC 3 giorni dopo placcatura. Frecce indicano i cluster proliferazione di NSC. Originale ingrandimento; 20x

Figura 2. Primaria E14 cultura NSC 7 giorni dalla placcatura. Originale ingrandimento; 10x

Figura 3. Passage uno E14 neurosfere 5 giorni dopo la placcatura. Si noti la micro-spikes (frecce) alla periferia delle sfere. Ingrandimento originale; 20x

Discussion

Il dosaggio neurosfere è il metodo di scelta per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali ^1-5 per la sua semplicità e riproducibilità. Questo saggio è uno strumento prezioso per la grande generazione di cellule precursori indifferenziati sistema nervoso centrale, che potrebbe essere utilizzato sia per in vitro e in vivo. Va sottolineato che neurosfere potrebbe essere generato sia dalla bona fide cellule staminali e progenitori neurali più ristretto. Pertanto, il calcolo della frequenza di neurosfere formando sovrastima semplicemente il numero di NSCs in buona fede in una data popolazione di cellule neurali ^6. Per stimare la frequenza di NSCs buona fede, si consiglia vivamente di utilizzare il Colony Forming neurali Assay Cell (N-ACCP), che è stato sviluppato per questo scopo ^7.

Per avere un elevato e coerente cultura della qualità neurosfere E14 NSCs, si consiglia di:

1. Per preparare gli oggetti necessari prima di iniziare a raccogliere gli embrioni.
2. Per mantenere gli embrioni in HEM freddo o basale medio NSC tutta la dissezione.
3. Per eseguire la dissezione il più rapidamente possibile (entro 1 ora), come tessuto diventa morbido e appiccicoso nel tempo e può essere difficile da sezionare.
4. Non lasciare che la sfera crescere troppo. Di solito dovrebbero essere sotto-colta ogni 5-7 giorni a seconda delle dimensioni delle sfere.
5. Per trypsinize le sfere con le dimensioni di 150-200 micron per 2-3 minuti. Lasciando tripsina per più di 3 minuti provoca danni alle cellule e di efficienza della sfera formando diminuisce e le cellule tendono a collegare i piatti della cultura e differenziare.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
Fine curved forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11251‐35
Small fine forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11272‐30
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050‐10
Fine scissors	Surgical tools	World Precision Instruments, Inc.	500216
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.