Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Summary

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do ensaio neurosphere para o isolamento e expansão de células-tronco neurais do eminências ganglionares do dia 14 de embriões de rato-cérebro.

Abstract

Em mamíferos, as células-tronco atua como uma fonte de células indiferenciadas para manter gênese ea renovação celular em diferentes tecidos e órgãos, durante o tempo de vida do animal. Eles podem potencialmente substituir as células que são perdidas no processo de envelhecimento ou em processo de lesão e doença. A existência de células-tronco neurais (NSCs) foi primeiramente descrita por Reynolds e Weiss (1992) no adulto sistema central de mamíferos nervoso central (SNC), utilizando um novo sistema de cultura sem soro, o ensaio neurosphere (NSA). Com este ensaio, também é possível isolar e ampliar NSCs de diferentes regiões do SNC embrionárias. Estes, NSCs vitro expandidas são multipotentes e podem dar origem aos três principais tipos de células do SNC. Enquanto a NSA parece relativamente simples de executar, atenção para os procedimentos demonstrado aqui é necessário para alcançar resultados confiáveis ​​e consistentes. Este vídeo demonstra praticamente NSA para gerar e expandir NSCs partir do dia 14 de embriões de rato-tecido cerebral e fornece detalhes técnicos para que se possa atingir culturas neurosphere reprodutível. O procedimento inclui a colheita E14 embriões de camundongos, microdissecção cérebro para colher as eminências ganglionares, a dissociação do tecido colhido em meio NSC para ganhar uma suspensão de células individuais, e, finalmente, cultivo de células em cultura NSA. Depois de 5-7 dias em cultura, o que resulta neurospheres primários são várias passagens para expandir ainda mais o número do NSCs para futuros experimentos.

Protocol

1. Configuração básica antes de prosseguir para dissecção:

1. Volume apropriado de meio NSC completo é preparado pela mistura NeuroCult NSC Basal Medium e Suplementos NeuroCult NSC Proliferação na proporção 9:1, respectivamente.
2. O meio é aquecido em banho-maria a 37 ° C.
3. Frio HEPES-buffered meio mínimo essencial (HEM), com alta concentração de antibióticos (10%) está preparado para dissecção e propósito de lavar roupa. Alternativamente, NSC meio basal com a suplementação de antibióticos também pode ser utilizado para esta finalidade.
4. 25-30 mL de HEM frio contendo antibióticos é dispensada em tubos de 50 ml estéril para a coleta dos embriões.
5. Vários pratos de plástico Petri 10 centímetros são necessários para manter os embriões e os cérebros durante a dissecção e também para manter o tecido dissecado.
6. Os instrumentos cirúrgicos, necessários para remover os embriões (tesouras grandes, pequenas tesouras pontudas, pinças grandes, pequenas pinças curvas) ou para a dissecção do cérebro embrionário (pequeno fórceps, pinças curvas finas, em ângulo de 45 ° pinças finas e pequenas tesouras) são esterilizados usando conta de vidro estufa a 250 ° C ou outros métodos disponíveis autoclave.
7. Microscópio de dissecção é limpa com álcool 70% e criar dentro de um fluxo laminar ou capuz PC2.

2. Colheita E14 Cérebro de Rato e Micro-dissecção:

1. Uma vez acoplado rato grávida é anestesiado no dia 14 ^de gestação de acordo com um protocolo de animais institucional aprovado.
2. Deslocamento cervical é realizada para se certificar de que o animal não sofre dor e angústia.
3. O rato anestesiado é colocado em sua parte traseira em um lenço de papel absorvente, eo abdômen é lavado com etanol 70% para esterilizar a área.
4. A pele sobre o abdômen é apreendido com uma pinça grande, e, em seguida, a pele ea fáscia é cortado com uma tesoura grande para expor a cavidade abdominal e os cornos uterinos.
5. O útero são removidos com uma pinça e tesouras pequenas e são transferidos para um tubo contendo 50 ml cônico HEM frio.
6. Os tecidos uterinos são transferidos para a capa e depois lavados uma ou duas vezes com volume suficiente de HEM estéril limpa e fria para remover possíveis contaminantes como o sangue e cabelo.
7. Os tecidos uterinos são então transferidos para um prato de Petri contendo 10 centímetros HEM frio.
8. Os cornos uterinos são abertos usando pequenas pinças e tesouras curvas e os embriões são transferidos para um prato de 10 centímetros novo, que contém HEM frio.
9. As cabeças dos embriões são separados ao nível da medula espinhal cervical e transferidos para outra placa de Petri contendo HEM frio.
10. Placa de Petri é transferida sob um microscópio de dissecação para remover o cérebro do crânio.
11. As cabeças são realizadas com uma pinça fina curva do lado caudal assim como o lado dorsal da cabeça são voltados para cima. Usando micro-tesouras, um primeiro corte horizontal é feita acima dos olhos e, em seguida, continuou na linha mediana da testa para a parte traseira da cabeça. Certifique-se de cortar a pele eo crânio e para não danificar o cérebro subjacente.
12. O cérebro é retirado do crânio, pressionando as bordas da seção de corte em um movimento para trás usando a pinça curva. Este procedimento continua até que todos os cérebros são removidos os crânios.
13. O cérebro é mantida constante utilizando a pinça curva de modo que o lado dorsal é voltada para cima e em seguida, usando microtesoura um corte é realizado através do córtex de cada hemisfério se estende do bulbo olfatório à parte traseira do hemisfério para expor as eminências ganglionares.
14. Usando a pinça curva em uma mão e as pinças de 45 ° angulada no outro, as abas de corte de córtices estão espalhados e as eminências ganglionares são dissecados.
15. O tecido dissecado é colocado em um prato de 10 centímetros de Petri estéreis, e este procedimento é repetido até que todos os cérebros foram micro-dissecados.
16. Pedaços de tecidos são coletadas utilizando 1 mL de meio de NSC em uma ponta da pipeta 1 mL e transferido para um tubo de centrifugação de 15 mL.
17. Tecido é então dissociado completamente, mas com cuidado, pressionando a ponta da pipeta no fundo do tubo e pipetar a suspensão para cima e para baixo. Desta forma, os aglomerados são quebrados em uma única célula. Pipetagem é realizado 3-4 vezes para que uma suspensão leitosa como é alcançado. Então, a suspensão é deixada em repouso por 1-2 minutos, de modo a clumps não dissociada precipitados.
18. Quase a suspensão célula inteira é transferida para outro tubo e depois outro de 1 mL de meio de NSC é adicionado ao clumps restantes e dissociado a única célula, como descrito.
19. O conteúdo dos tubos são reunidos e centrifugados por 5 minutos em temperatura ambiente, a 700rpm (110g).
20. O sobrenadante é aspirado off até o pellet real, e as células são ressuspendidas em 1 mL de meio de NSC completa.
21. O meio é gentilmente pipetado cima e para baixotem uma suspensão celular homogênea único.
22. 10 L da suspensão de células é misturado com 90 mL de azul de tripano para realizar uma contagem de células.
23. Finalmente, as células são banhados na densidade de 2x10 ⁵ células / mL em meio NSC completo suplementado com 20ng / mL fator de crescimento epidérmico (EGF). 5 mL médio é usado para T25, T75 para 20 mL e 40 mL para frascos T175.
24. Neurospheres são formados em 5-7 dias, quando incubados a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO _2. Em 6-7 dias, as esferas devem medir entre 150-200 microns e estará pronto para subcultura (passagem).

3. Passaging e Expansão da NSCs embrionárias:

1. Quando o neurospheres estão prontos para subcultura (150-200 m de diâmetro), o meio com esferas suspensão é removido dos frascos, colocado em um tubo de cultura apropriada estéril tamanho do tecido, e centrifugado a 700 rpm (110 g) por 5 min em temperatura ambiente.
2. O sobrenadante é descartado e as esferas são suspensas em 1 mL de 0,05% de tripsina-EDTA.
3. A suspensão de células é, então, incubadas em banho-maria a 37 ° C por 2-3 min, em seguida, um volume igual de inibidor de tripsina de soja é usado para interromper a atividade de tripsina.
4. A suspensão de células é suavemente pipetado cima e para baixo para garantir que a tripsina foi completamente inativada.
5. A suspensão celular é centrifugado a 700 rpm (110g) por 5 min. Então, o sobrenadante é removido e as células são ressuspendidas em 1 mL de meio de NSC completa.
6. 10 L da suspensão de células é misturado com 90 mL de azul de tripano para realizar uma contagem de células.
7. As células são banhados em uma concentração de 5x10 ⁴ células / mL em meio NSC completo suplementado com 20ng / mL EGF em um frasco apropriado cultura dimensão do tecido. 5 mL médio é usado para T25, T75 para 20 mL e 40 mL para frascos T175.
8. Neurospheres secundário são formados em 5-7 dias, quando incubados a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO _2.

4. Resultados representativos:

No ensino primário cultura NSC embrionárias, a maioria das células vai se tornar hipertrófica e anexar aos pratos de cultura de tecidos em placas. Embora a maioria das células vão morrer ou diferenciar, depois de 2-3 dias, as células proliferativas fazer pequenos aglomerados de células que irá separar a partir do substrato (Figura 1). Formação de grandes agregados esferoidais nas primeiras 48 horas de cultura não deve ser confundida com esferas primárias. Formação de agregados depende principalmente da quantidade de detritos e pedaços de tecido não-dissociada da cultura. Neurospheres verdadeiros são os fase brilhante e tornar-se mais esférico à medida que aumenta de tamanho (Figura 2). Microspikes pequena aparece na superfície externa das esferas viável e saudável (Figura 3). Depois de 5-7 dias, as esferas devem ser redondos, mas não compactado, e deve medir entre 150 e 200 m de diâmetro. Se neurospheres são permitidos a crescer muito grande (após 90-10 dias em cultura), eles podem formar agregados ou tornar-se de cor escura por causa da morte de células no centro das esferas (ver vídeo). Neurospheres grande poderia, eventualmente, começam a se diferenciar in situ (fixação ao substrato e migrando para a periferia). Também é difícil dissociar neurospheres grande e subcultura-los.

Figura 1. Primário E14 cultura NSC três dias após o plaqueamento. Setas mostram a proliferação de agrupamentos NSCs. Ampliação original; 20x

Figura 2. Primária E14 cultura NSC 7 dias após o plaqueamento. Ampliação original; 10x

Figura 3. Passage um E14 neurospheres cinco dias após o plaqueamento. Observe a picos de micro-(setas) na periferia das esferas. Ampliação original; 20x

Discussion

O ensaio neurosphere é o método de escolha para o isolamento e expansão de células-tronco neurais ^05/01 devido à sua simplicidade e reprodutibilidade. Este ensaio é uma ferramenta inestimável para a geração em larga escala de células indiferenciadas células do SNC precursor, o que poderia ser usado para ambos in vitro e in vivo. Deve ser enfatizado que neurospheres poderiam ser gerados a partir de ambos os bona fide células-tronco neurais e progenitores mais restrito. Portanto, o cálculo da frequência neurosphere formando simplesmente superestima o número de bona fide NSCs em qualquer população dada célula neural ^6. Para estimar a freqüência de bona fide NSCs, é fortemente recomendado usar a Colony Forming Assay Neural Cell (N-ACCP), que foi desenvolvido para essa finalidade ^7.

Para se ter uma cultura neurosphere consistente alta qualidade de E14 NSCs, recomendamos:

1. Para preparar os itens necessários antes de começar a colheita dos embriões.
2. Para manter os embriões no HEM frio ou médio NSC basal durante dissecção.
3. Para realizar a dissecação o mais rápido possível (dentro de 1 h), como o tecido fica mole e pegajosa ao longo do tempo e podem ser difíceis de dissecar.
4. Para não deixar a esfera crescer muito. Normalmente, eles devem ser sub-cultivadas a cada 5-7 dias, dependendo do tamanho das esferas.
5. Para trypsinize as esferas com o tamanho de 150-200 mm para 2-3 minutos. Deixando de tripsina por mais de 3 minutos provoca danos às células e formando a esfera da eficiência irá diminuir e as células tendem a fixar a placas de cultura e diferenciar.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
Fine curved forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11251‐35
Small fine forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11272‐30
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050‐10
Fine scissors	Surgical tools	World Precision Instruments, Inc.	500216
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.