Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

Summary

Dieses Video-Protokoll zeigt die Anwendung der Neurosphäre Assay für die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen, die aus den Ganglien-Eminenzen der embryonalen Tag 14-Maus-Gehirn.

Abstract

In Säugetieren wirkt Stammzellen als Quelle von undifferenzierten Zellen zu Zelle Entstehung und Erneuerung in verschiedenen Geweben und Organen während der Lebensdauer des Tieres zu erhalten. Sie können möglicherweise ersetzen Zellen, die in den Alterungsprozess oder in den Prozess der Verletzungen und Krankheiten verloren gehen. Die Existenz von neuralen Stammzellen (NSCs) wurde zuerst von Reynolds und Weiss (1992) in der erwachsenen Säugetieren zentralen Nervensystems (ZNS) mit einem neuartigen serumfreien Kultur-System, das Neurosphäre Assay (NSA) beschrieben. Unter Verwendung dieses Tests ist es auch möglich zu isolieren und zu erweitern NSCs aus verschiedenen Regionen des embryonalen ZNS. Diese in vitro erweitert NSCs sind multipotente und kann zu den drei wichtigsten Zelltypen des ZNS geben. Während die NSA scheint relativ einfach durchzuführen, um die Verfahren demonstriert hier Aufmerksamkeit erforderlich ist, um verlässliche und konstante Ergebnisse zu erzielen. Dieses Video zeigt praktisch NSA zu erzeugen und zu erweitern NSCs aus embryonalen Tag 14-Maus-Gehirngewebe und erbringt technische Details so dass man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen. Das Verfahren schließt die Gewinnung E14 Mausembryonen, Gehirn Mikrodissektion zu den Ganglien-Eminenzen, Dissoziation des geernteten Gewebes in NSC Medium Ernte einer einzigen Zellsuspension zu gewinnen, und schließlich plating Zellen in NSA Kultur. Nach 5-7 Tagen in Kultur, sind die resultierenden primären Neurosphären passagiert weiter ausbauen die Anzahl der NSCs für zukünftige Experimente.

Protocol

1. Basic Set Up Bevor wir Dissection:

1. Entsprechende Volumen der kompletten NSC Medium wird hergestellt, indem NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Supplements bei einem 9:1-Verhältnis, bzw. vorbereitet.
2. Das Medium wird in einem 37 ° C Wasserbad erwärmt.
3. Kalte HEPES-gepufferte Minimum Essential Medium (HEM) mit einer hohen Konzentration von Antibiotika (10%) ist für die Präparation und Waschen Zweck vorbereitet. Alternativ können NSC Basalmedium mit Antibiotika-Supplementierung ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden.
4. 25-30 ml kaltem HEM mit Antibiotika ist in sterile 50 ml Röhrchen für Entnahme der Embryonen verzichtet.
5. Mehrere 10cm Petrischalen aus Kunststoff sind notwendig, um die Embryonen und Hirn bei der Präparation zu halten und auch seziert Gewebe zu halten.
6. Die chirurgische Instrumente, notwendig, um die Embryonen (große Schere, kleine spitze Schere, Pinzette große, kleine gebogene Pinzette) oder für die embryonale Gehirn Dissektion (kleine Pinzette, gebogen feinen Pinzette, 45 ° abgewinkelt feinen Pinzette und eine kleine Schere) zu entfernen sind sterilisiert mit Glasperlen Sterilisator bei 250 ° C oder anderen verfügbaren Autoklav-Verfahren.
7. Dissection Mikroskop ist mit 70% igem Alkohol abgewischt und im Inneren einer laminaren Strömung oder PC2 Haube gesetzt.

2. Harvesting E14 Maus Brain and Micro-Dissektion:

1. Ein Mal gedeckt schwangere Maus ist am Tag betäubt den ^14. Schwangerschaftswoche nach einem institutionellen genehmigt Tier-Protokoll.
2. Genickbruch wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Tier nicht leidet Schmerzen und Leiden.
3. Die narkotisierten Maus auf dem Rücken auf einem saugfähigen Papiertuch gelegt, und der Bauch ist mit 70% Ethanol gespült, um den Bereich zu sterilisieren.
4. Die Haut über dem Bauch gegriffen mit einer großen Zange, und dann die Haut und das darunterliegende Faszie wird mit großer Schere geschnitten, um die Bauchhöhle und die Uterushörner aussetzen.
5. Die Uteri werden mit kleinen Zangen und Scheren entfernt und sind in einem 50-ml konischen Rohr-haltigen Kälte HEM übertragen.
6. Die uterine Gewebe sind an der Haube übertragen und dann ein-oder zweimal mit genügend Volumen von frischem sterilen kalten HEM gespült, um mögliche Verunreinigungen wie Blut und Haare zu entfernen.
7. Die uterine Gewebe werden dann zu einer 10cm Petrischale mit kaltem HEM übertragen.
8. Die Uterushörner werden geöffnet, indem kleine gebogene Pinzette und Schere und die Embryonen werden in eine neue 10cm Schüssel, die kalte HEM enthält übertragen.
9. Die Köpfe der Embryonen werden bei der zervikalen Rückenmarks Ebene aufgetrennt und auf eine andere Petrischale mit kaltem HEM.
10. Die Petrischale wird unter einem Binokular übertragen auf das Gehirn aus dem Schädel zu entfernen.
11. Die Köpfe sind mit einer feinen gebogenen Pinzette aus der kaudalen Seite, so der Rückenseite des Kopfes nach oben zeigen statt. Mit Mikro-Schere wird zunächst ein horizontaler Schnitt oberhalb der Augen gemacht und dann weiter in der Mittellinie von der Stirn auf die Rückseite des Kopfes. Vergewissern Sie sich durch die Haut und den Schädel geschnitten und nicht auf die zugrunde liegende Hirnschädigung.
12. Das Gehirn ist vom Schädel, indem Sie die Ränder der Schnittfläche in einer Rückwärtsbewegung mit den gebogenen Pinzette entfernt. Dieses Verfahren wird fortgesetzt, bis alle Gehirne aus dem Schädel entfernt werden.
13. Das Gehirn ist stabil gehalten mit dem gebogenen Pinzette, so dass die Rückenseite nach oben und dann mit Blick über Mikroschere einen Schnitt durch die Rinde der beiden Hemisphären, die sich von den Riechkolben an der Rückseite der Hemisphäre zu den Ganglien-Eminenzen aussetzen durchgeführt wird.
14. Mit der gebogenen Pinzette in der Hand und der 45 ° abgewinkelte Pinzette in der anderen werden die geschnittenen Klappen Kortex verteilt und den Ganglien-Eminenzen sind herauspräpariert.
15. Die sezierten Gewebes wird in einer sterilen 10cm Petrischale gelegt, und dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis alle die Gehirne wurden Mikro-seziert.
16. Gewebestücke werden gesammelt, indem 1 mL der NSC-Medium in einem 1 mL Pipette und in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen.
17. Das Gewebe wird dann dissoziiert gründlich, aber sanft, indem Sie die Pipettenspitze auf den Boden der Röhre und Pipettieren der Suspension auf und ab. Auf diese Weise die Klumpen sind in einzelne Zellen gebrochen. Pipettieren ist 3-4 mal so, dass eine milchige wie Federung erreicht wird durchgeführt. Dann wird die Suspension für 1-2 Minuten so zufrieden wie die nicht-dissoziierten Klumpen ausfällt.
18. Fast die gesamte Zellsuspension wird auf die andere überführt und dann noch 1 ml NSC Medium ist, um die verbleibenden Klumpen und dissoziiert einzelne Zelle wie oben beschrieben aufgenommen.
19. Der Inhalt der Rohre werden gepoolt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, bei 700rpm (110g).
20. Der Überstand wird abgesaugt bis zur eigentlichen Pellet, und die Zellen werden in 1 ml komplettem NSC-Medium resuspendiert.
21. Das Medium wird sanft auf und pipettiert biseine homogene einzigen Zellsuspension.
22. 10 ul der Zellsuspension mit 90 ul von Trypanblau auf eine Zellzahl führen gemischt.
23. Schließlich werden die Zellen bei der Dichte von 2x10 ⁵ Zellen / ml in kompletten NSC Medium mit 20ng / ml epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ausplattiert. 5 ml Medium für T25, 20 mL für T75 und 40 mL für T175 Flaschen verwendet.
24. Neurosphären sind in 5-7 Tagen gebildet werden, wenn bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO ₂ inkubiert. In 6-7 Tagen sollte die Sphären zwischen 150-200 Mikrometer messen und bereit sein wird, Subkultur (Durchgang).

3. Die Passage und Expansion von embryonalen NSCs:

1. Wenn die Neurosphären bereit für Subkultur (150-200 &mgr; m Durchmesser) sind, ist das Medium, mit hängenden Kugeln aus den Flaschen entfernt, in einer angemessenen Größe sterile Zellkulturgefäß und zentrifugiert bei 700 rpm (110 g) für 5 min bei Raumtemperatur.
2. Der Überstand wird verworfen und die Kugeln sind in 1 ml% 0,05 Trypsin-EDTA resuspendiert.
3. Die Zellsuspension wird dann in einem 37 ° C Wasserbad für 2-3 min inkubiert, dann ein gleiches Volumen an Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor verwendet wird, um das Trypsin zu stoppen.
4. Die Zellsuspension wird vorsichtig nach oben und unten pipettiert, um sicherzustellen, dass die Trypsin wurde komplett inaktiviert.
5. Die Zellsuspension wird bei 700 rpm (110g) für 5 min zentrifugiert. Dann wird der Überstand abgenommen und die Zellen werden in 1 ml komplettem NSC-Medium resuspendiert.
6. 10 ul der Zellsuspension mit 90 ul von Trypanblau auf eine Zellzahl führen gemischt.
7. Die Zellen werden in einer Konzentration von 5x10 ⁴ Zellen / ml in kompletten NSC Medium mit 20ng / ml EGF in einer angemessenen Größe Zellkulturflasche ausplattiert. 5 ml Medium für T25, 20 mL für T75 und 40 mL für T175 Flaschen verwendet.
8. Sekundäre Neurosphären sind in 5-7 Tagen gebildet werden, wenn bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO ₂ inkubiert.

4. Repräsentative Ergebnisse:

In primären embryonalen NSC Kultur, wird die Mehrheit der Zellen hypertrophe geworden und heften sich an das Gewebe Kulturschalen auf Plattierung. Während die Mehrheit der Zellen entweder sterben oder zu differenzieren, nach 2-3 Tagen, um proliferative Zellen kleine Gruppen von Zellen, die aus dem Substrat (Abbildung 1) lösen wird. Bildung von großen kugelförmigen Aggregaten in den ersten 48-Stunden-Kultur sollte nicht für die primäre Sphären verwechselt werden. Aggregatbildung hängt hauptsächlich von der Mengen von Schutt und nicht-dissoziierten Gewebe Klumpen in der Kultur. Wahre Neurosphären werden Phase hell und werden mehr als sphärische Größe zunimmt (Abbildung 2). Kleine microspikes erscheint auf der äußeren Oberfläche des lebensfähig und gesund Kugeln (Abbildung 3). Nach 5-7 Tagen, müssen die Kugeln rund sein, aber nicht verdichtet, und sollte zwischen 150 und 200 um im Durchmesser messen. Wenn Neurosphären erlaubt sind zu groß werden (nach 9-10 Tagen in Kultur), könnten sie Aggregate bilden oder dunkel in der Farbe, weil der Zelltod in der Mitte der Kugeln (siehe Video). Große Neurosphären könnten irgendwann anfangen zu in situ zu unterscheiden (Befestigung auf dem Substrat und die Migration in Richtung der Peripherie). Es ist auch schwierig, große Neurosphären distanzieren und Subkultur sie.

Abbildung 1. Primary E14 NSC Kultur 3 Tage nach dem Ausplattieren. Die Pfeile zeigen die proliferierenden Cluster von NSCs. Original-Vergrößerung; 20x

Abbildung 2. Primäre E14 NSC Kultur 7 Tage nach dem Ausplattieren. Original-Vergrößerung, 10x

Abbildung 3. Gang sind E14 Neurosphären 5 Tage nach dem Ausplattieren. Beachten Sie die Mikro-Spikes (Pfeile) an der Peripherie der Kugeln. Original-Vergrößerung, 20x

Discussion

Die Neurosphäre Test ist die Methode der Wahl für die Isolierung und Expansion von neuralen Stammzellen ^1-5 wegen seiner Einfachheit und Reproduzierbarkeit. Dieser Assay ist ein unschätzbares Werkzeug für Großanlagen von undifferenzierten Vorläuferzellen ZNS, die sowohl für in vitro und in vivo-Studien verwendet werden könnte. Es sollte betont werden, dass Neurosphären sowohl von der bona fide neuralen Stammzellen und mehr eingeschränkt Vorfahren konnten generiert werden kann. Daher Berechnung der Neurosphäre bilden Frequenz einfach überschätzt die Zahl der bona fide NSCs in jedem neuronalen Zellen Bevölkerung ^6. Zur Abschätzung der Häufigkeit von bona fide NSCs, ist es dringend empfohlen, die Neural Colony Forming Zell-Assay-(N-EUFA), die zu diesem Zweck ⁷ wurde entwickelt verwenden.

Um eine gleichbleibend hohe Qualität Neurosphäre Kultur des E14 NSCs, empfehlen wir:

1. Um benötigte Gegenstände vor Beginn der Embryonen Ernte vorzubereiten.
2. Um die Embryonen in kaltem HEM oder basale NSC Medium in Dissektion.
3. Um Dissektion so schnell wie möglich (innerhalb von 1 h), wie Gewebe weich und klebrig im Laufe der Zeit wird und kann schwierig sein, zu sezieren.
4. Nicht, damit die Kugel zu viel wachsen. Normalerweise sollten sie subkultiviert alle 5-7 Tage, je nach Größe der Kugeln sein.
5. Um trypsinize die Kugeln in der Größe von 150-200 um für 2-3 Minuten. Verlassen Trypsin für mehr als 3 Minuten zu einer Schädigung der Zellen und die Kugel bilden Effizienz sinkt und die Zellen dazu neigen, die Kulturschalen befestigen und zu differenzieren.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
Fine curved forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11251‐35
Small fine forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11272‐30
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050‐10
Fine scissors	Surgical tools	World Precision Instruments, Inc.	500216
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.