Summary
Este protocolo describe una pantalla de alto rendimiento para la actividad celulolítica de una biblioteca metagenómica expresado en Escherichia coli. La pantalla es la solución de base y altamente automatizado, y utiliza una olla de la química en microplacas de 384 y con la lectura final como una medida de la absorbancia.
Abstract
Celulosa, la fuente más abundante de carbono orgánico en el planeta, tiene una amplia gama de aplicaciones industriales con creciente énfasis en la producción de biocombustibles 1. Métodos químicos para modificar o degradar la celulosa por lo general requieren ácidos fuertes y altas temperaturas. Por lo tanto, los métodos enzimáticos se han convertido en prominente en el proceso de bioconversión. Mientras que la identificación de las celulasas activa de los aislamientos de bacterias y hongos ha sido algo eficaz, la gran mayoría de los microbios en la naturaleza resistir el cultivo de laboratorio. Genómica medioambiental, también conocido como enfoques metagenómica, la selección tiene una gran promesa en la reducción de la brecha de cultivo en la búsqueda de enzimas bioconversión novela. Métodos de detección metagenómica ha recuperado celulasas novela de entornos tan variados como los suelos 2, 3 y búfalos rumen de las termitas traseras-gut 4 utilizando carboximetilcelulosa (CMC) placas de agar se tiñeron con colorante rojo Congo (basado en el método de Teatro y Madera 5). Sin embargo, el método CMC está limitado en el rendimiento, no es cuantitativo y se manifiesta una señal de baja a ruido 6. Otros métodos se han reportado 7,8, pero cada uno utiliza una placa de agar-ensayo basado, que es indeseable para la selección de alto rendimiento de las grandes bibliotecas de insertar genómica. Aquí les presentamos una solución basada en la pantalla de actividad de celulasa usando un dinitrofenol cromogénico (DNP)-cellobioside sustrato 9. Nuestra biblioteca fue clonado en el control de copia PCC1 fosmid para aumentar la sensibilidad del ensayo a través de la inducción de copiar el número 10. El método utiliza una olla de la química en 384 pocillos con la lectura final, siempre como una medida de la absorbancia. Esta lectura es cuantitativo, sensible y automatizada con un rendimiento de hasta 100 veces las placas de 384 pocillos al día usando un manejador de líquidos y lector de placas con sistema conectado de apilamiento.
Protocol
Antes de iniciar este protocolo, tendrá que tener su biblioteca metagenómica almacenados en un formato de placa de 384 pocillos. En nuestro estudio, hemos utilizado el vector de control de copia PCC1 fosmid en combinación con el fago T1-resistentes TransforMax EPI300-T1 R E. células de E. coli como el anfitrión de la biblioteca y se almacenan nuestros platos a -80 ° C 11.
1. La replicación de las placas biblioteca metagenómica
- Descongelar las placas que contienen la biblioteca a 37 ° C durante aproximadamente 20 minutos, o hasta que todos los pozos se descongelan.
- Utilice la función de la luz ultravioleta en la esterilización de qPix2 para esterilizar el robot durante 15 minutos.
- Preparar el caldo LB con cloranfenicol a una concentración final de 12.5ug/mL y arabinosa en 100ug/mL en una botella de 500 ml de reactivo. Cada placa se utilizan aproximadamente 20 ml, además de hacer un adicional de 50 ml para permitir el volumen muerto.
- Configurar el qFill3 como las instrucciones del fabricante con la botella de los medios de comunicación conectado al colector a través de la tubería estéril. Programa que por la cantidad apropiada de los medios de comunicación, y la puso para llenar un volumen 45uL en cada pozo.
- Purgar el aire de la tubería y el colector con la característica de purga del robot hasta que los medios de comunicación se ve que proviene de cada pin del colector.
- Rellene el número deseado de placas con medio LB con el qFill3. Cada placa tiene unos 20 segundos para completar.
- La carga de las placas de la biblioteca y las placas nuevas en las áreas apropiadas del robot qPix2. Rellene los baños de limpieza con los reactivos adecuados, el 2% Micro90 en el baño trasero, autoclave agua destilada en el baño de media, el 80% de etanol en el baño principal.
- Utilice la opción "replicar" el programa de la qPix2. En el software, seleccionar el número apropiado cabeza, y los tipos de platos de origen y destino de las placas. También estableció la cabeza para limpiar entre repeticiones, generalmente 6 ciclos en cada baño es suficiente. Capacidad de la máquina es de 10 platos a la vez, y se tarda aproximadamente 15 minutos para replicar a todos con una cabeza de alfiler 384 (o aproximadamente 50 minutos con una cabeza de alfiler 96).
Nota: Hay una opción de "Stir Fuente" o "Stir destino". Se recomienda no utilizar estas opciones como los problemas han ocurrido previamente con nuestro robot utilizando. - Una vez que las placas se replican, crecen las placas a 37 ° C durante 24 horas en una caja de humedad. Debido a que estamos induciendo un alto número de copias de fosmid con la adición de arabinosa, los clones tienden a crecer más lentamente que no inducida clones. Retorno de las placas de la biblioteca a -80 ° C.
Nota: La incubación de un cuadro de la humedad garantiza la evaporación de los medios de comunicación no se produce en los pozos en el borde de las placas, manteniendo un entorno uniforme para todos los pozos. - Limpie el robot qFill3 por primera purga de agua (~ 50 ml) y 80% de etanol (~ 50 ml). Desmontar los componentes, y limpiar y esterilizar en autoclave de la botella, la tapa y el tubo envuelto en papel de aluminio.
2. La medición del crecimiento de E. Clones coli
- Quitar las placas de 37 ° C incubadora. Retirar y reservar las tapas, placas y colocarla sobre la plataforma de carga siempre con la revista RapidStak, hasta un máximo de 25 placas.
Nota: La placa en la parte inferior de la pila será el primero en ser leído. Asegúrese de no perder de vista el orden de los platos, ya que el software no registra esto. - Quitar una revista de la Stak rápida, asegúrese de que está vacía, y pulsar en la pila de platos para ser leído. Datos por el mango, y las placas de todos debe ser cargado en la revista. Cargar el cargador en el RapidStak.
Nota: La revista tiene un pequeño tornillo en la esquina que indica que los pozos A1 esquina de las placas debe ir. La revista sólo se montará en el RapidStak en una orientación. - Abra el programa RE SkanIt en el ordenador conectado a las máquinas. Seleccione "Nueva sesión" con un nombre adecuado. Seleccione la opción "Corning fondo plano de 384 y placa" como el tipo de plato.
- En el "Diseño de placa", seleccione el "Mago" botón, y quiero que añadir 384 incógnitas a su plato.
- En el "Protocolo", seleccione el "Loop Bueno" y, a entrar para 384 pozos. Un "Loop Bueno" aparece en el flujo de árbol en el lado izquierdo de la pantalla. Seleccione el icono y haga clic para añadir "medición fotométrica". Lo puso a leer a 600 nm.
- Guarde su protocolo con un nombre único, y cerrar el programa RE SkanIt.
- En el equipo, abra el programa PolaraRS.
- En la página principal habrá listado de los instrumentos conectados al dispositivo RapidStak. El VarioSkan debe estar en el lado izquierdo de la mesa. Bajo el título VarioSkan, habrá dos enlaces, "RunSession" y la "incubación". Haga clic en el "RunSession" opción.
- Aparecerá una nueva ventana, la ventana de análisis, aparecerá con un diagrama de flujo en el medio. Seleccione la opción "RunSession" tema (debe ser el presente artículo solamente). En la parte derecha de la pantalla un menú desplegableaparecerá. Busque el nombre de su RE SkanIt salvo correr en este menú.
Nota: No parece haber ningún orden racional a este menú. No es por orden alfabético o por fecha de añadido, o en relación con que en la computadora el protocolo se guarda. Esto significa que debe mirar a través de todos los protocolos antes de encontrar su propio, que es un dolor. - Una vez que haya seleccionado el protocolo, en la esquina superior derecha, haga clic en "Ejecutar este ensayo".
- Una ventana pop-up, le pide que denotan que la revista va a utilizar como fuente, y que la revista está vacío. El cuadro inferior de la pantalla se corresponde con la revista delante. [Opcional: Se le pedirá que introduzca el número de placas de carga para determinar una estimación de la cantidad de tiempo que tomará. Esta estimación es normalmente muy lejos.]
- Asegurar tanto la RapidStak VarioSkan y se encienden, y presiona "Aceptar".
- El RapidStak se cargará automáticamente en sus placas en el lector de placas, lo que permite realizar mediciones continuas de las placas. Para leer 25 placas de aproximadamente 50 minutos.
Nota: Se recomienda observar la carga en la primera placa VarioSkan para asegurar una alineación correcta de las máquinas. Si el RapidStak no se carga correctamente el lector de placas, el uso de la "pausa este ensayo" en la esquina superior derecha de la ventana PolaraRS. - Una vez que el VarioSkan se hace la lectura de todos los platos, quitar el cargador lleno y lo coloca en la plataforma de carga revista. Levante el rectángulo exterior de la plataforma, y la revista debe deslizarse, dejando las placas de pie en una pila en el centro. Vuelva a colocar las tapas de las placas adecuadas.
3. Además de la mezcla de ensayo a cada plato
- Prepare la mezcla de ensayo utilizando acciones premade 10x de la mezcla de lisis (10% Triton X-100, 100mm ris, 10 mM EDTA) en tampón 50 mM de acetato de potasio a pH 5,5. Prepare un inventario de hasta 75mg/mL DNP-cellobioside sustrato en DMSO, asegurándose de que el sustrato esté completamente disuelta. Añadir DNP-cellobioside solución de reserva de mezcla de ensayo a una concentración final de 0.1mg/mL. Cada placa se utilizan aproximadamente 20 ml de la solución, además de hacer un adicional de 50 ml para permitir el volumen muerto.
Nota: DNP-Cellobioside no es fácilmente soluble en agua, por lo que se disuelve en DMSO aumenta la solubilidad. La presencia de DMSO en la solución final del ensayo no tiene efectos observables. - Configurar el qFill3 como las instrucciones del fabricante con la botella de los medios de comunicación conectado al colector a través de la tubería estéril. Programa que por la cantidad apropiada de los medios de comunicación, y la puso para llenar un volumen 45uL en cada pozo.
- Purgar el aire de la tubería y el colector con la característica de purga del robot hasta que los medios de comunicación se ve que proviene de cada pin del colector.
- Agregue la mezcla de ensayo para cada plato con el qFill3. Cada placa tiene unos 20 segundos para completar.
- Una vez que la mezcla de ensayo, se añade, se incuban las placas a 37 ° C en una caja de humedad durante 12-16 horas.
Nota: El exceso de incubación de las placas una vez que la mezcla de ensayo se añade hará que la evaporación en los pozos exterior de la placa, lo cual generará mayores lecturas de absorbancia a la observada para los pozos en el interior. Esto se puede compensar mediante la incubación de las placas en una cámara húmeda.
4. Absorción de la lectura de los clones ensayados
- Quitar las placas de 37 ° C incubadora. Retirar y reservar las tapas, placas y colocarla sobre la plataforma de carga siempre con la revista RapidStak, hasta un máximo de 25 placas.
Nota: La placa en la parte inferior de la pila será el primero en ser leído. Asegúrese de no perder de vista el orden de los platos, ya que el software no registra esto. - Quitar una revista de la Stak rápida, asegúrese de que está vacía, y pulsar en la pila de platos para ser leído. Datos por el mango, y las placas de todos debe ser cargado en la revista. Cargar el cargador en el RapidStak.
Nota: La revista tiene un pequeño tornillo en la esquina que indica que los pozos A1 esquina de las placas debe ir. La revista sólo se montará en el RapidStak en una orientación. - Abra el programa RE SkanIt en el ordenador conectado a las máquinas. Seleccione "Nueva sesión" con un nombre adecuado. Seleccione la opción "Corning fondo plano de 384 y placa" como el tipo de plato.
- En el "Diseño de placa", seleccione el "Mago" botón, y quiero que añadir 384 incógnitas a su plato.
- En el "Protocolo", seleccione el "Loop Bueno" y, a entrar para 384 pozos. Un "Loop Bueno" aparece en el flujo de árbol en el lado izquierdo de la pantalla. Seleccione el icono y haga clic para añadir "medición fotométrica". Lo puso a leer a 400 nm.
- Guarde su protocolo con un nombre único, y cerrar el programa RE SkanIt.
- En el equipo, abra el programa PolaraRS.
- En la página principal habrá listado de los instrumentos conectados al dispositivo RapidStak. El VarioSkan debe estar en el lado izquierdo de la mesa. Bajo el título VarioSkan, habrá dos enlaces, "RunSession" y Incubat "e ". Haga clic en el" RunSession "opción.
- Aparecerá una nueva ventana, la ventana de análisis, aparecerá con un diagrama de flujo en el medio. Seleccione la opción "RunSession" tema (debe ser el presente artículo solamente). En la parte derecha de la pantalla un menú desplegable que aparece. Busque el nombre de su RE SkanIt salvo correr en este menú.
- Una vez que haya seleccionado el protocolo, en la esquina superior derecha, haga clic en "Ejecutar este ensayo".
- Una ventana pop-up, le pide que denotan que la revista va a utilizar como fuente, y que la revista está vacío. El cuadro inferior de la pantalla se corresponde con la revista delante. [Opcional: Se le pedirá que introduzca el número de placas de carga para determinar una estimación de la cantidad de tiempo que tomará. Esta estimación es normalmente muy lejos.]
- Asegurar tanto la RapidStak VarioSkan y se encienden, y presiona "Aceptar"
- El RapidStak se cargará automáticamente en sus placas en el lector de placas, lo que permite realizar mediciones continuas de las placas.
Nota: Se recomienda observar la carga en la primera placa VarioSkan para asegurar una alineación correcta de las máquinas. Si el RapidStak no se carga correctamente el lector de placas, el uso de la "pausa este ensayo" en la esquina superior derecha de la ventana PolaraRS. - Una vez que el VarioSkan se hace la lectura de todos los platos, quitar el cargador lleno y lo coloca en la plataforma de carga revista. Levante el rectángulo exterior de la plataforma, y la revista debe deslizarse, dejando las placas de pie en una pila en el centro. Las placas pueden ser eliminados de acuerdo a sus procedimientos de laboratorio.
- Para exportar las lecturas de absorbancia, software de código abierto RE SkanIt, y elegir la opción "Abrir un archivo existente".
- Seleccionar el directorio donde ha guardado la sesión, pulse el icono "+" para expandir la lista y bajo el título de la partida serán las opciones de la etiqueta "Contenedor de 1" a "Container N", dependiendo del número de placas. Seleccione la primera placa para ser analizados.
- En la barra de menú en la parte superior de la página, seleccione "Procesamiento de Datos> Informe / Exportar"
- Elija las opciones deseadas para la exportación.
Nota: yo normalmente seleccione "Diseño de placas" y "fotométrica" datos para la exportación. - Haga clic en "Ver informe" y luego "Archivo> Guardar". Seleccione el directorio deseado. El formato de salida es una hoja de cálculo Microsoft Excel
5. Resultados representante
Un ejemplo de las lecturas de absorbancia a partir de una sola placa de 384 y que contiene un clon positivo se muestra en la Figura 2. Los clones positivos muestran un marcado aumento de la absorción por los que no expresan actividad de celulasa. Las diferencias en el tiempo del ensayo, la ubicación y en la placa, o la concentración de DNP (puede ser introducido mediante el filtrado sin disolver DNP) pueden afectar las lecturas absolutas de absorbancia. Lecturas de absorbancia relativa, como la diferencia de absorbancia por encima del promedio o media de la placa de columna, son un método más robusto de la identificación de clones positivos celulasa.
Tras la identificación de clones positivos de las placas de la biblioteca, se recomienda para replicar todos los clones positivos en una nueva placa para la detección de secundaria. Esto elimina los efectos derivados de la ubicación y la variación o la placa y permite una comparación más directa entre los clones positivos.
Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo de alto rendimiento para una biblioteca metagenómica clonado en E. coli y se almacenan a -80 ° C.
Figura 2. Lecturas de absorbancia de una placa de 384 pocillos que contienen un clon positivo. Celulasa clones positivos se pueden identificar por absorción aumentado significativamente en los clones negativos.
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Discussion
Una pantalla de alto rendimiento para la detección rápida de la actividad celulolítica de una biblioteca genómica de gran metagenómica insertar ADN expresado en E. coli se describe en este protocolo. Este método es una mejora con respecto a la prueba CMC / Rojo Congo de uso común en la literatura. Es una solución basada, y permite una olla de detección química en placas de 384 pocillos, con el resultado final de las lecturas de absorbancia de un lector de placas que permite el análisis cuantitativo. La automatización de cada paso de este proceso permite la detección sin supervisión de más de 25 placas de 384 pocillos por hora. Los datos pueden exportarse fácilmente desde el software en una hoja de cálculo Microsoft Excel, permitiendo el análisis o el procesamiento por software de terceros.
Una limitación de este ensayo que existe en el potencial de expresión de proteínas exógenas en la E. coli anfitrión. Una biblioteca metagenómica contiene ADN de muchos organismos diferentes, sólo un subconjunto de lo que puede ser reconocido por el E. coli transcripción / maquinaria de traducción. Incluso cuando se expresa, productos exógenos de genes no pueden lograr debido a la funcionalidad de plegado inadecuado, el tratamiento o los inadecuados niveles de expresión. Estas limitaciones pueden ser parcialmente compensado mediante la utilización de sistemas de control de copia, como se ha visto en anteriores estudios funcionales de detección metagenómica. 12. El control de copia PCC1 fosmid utilizado aquí permite la inducción mediante la adición del inductor L-arabinosa, y el número aumenta a partir de una copia, a un máximo de 100 copias por célula 13. Estos sistemas se pueden mejorar los resultados de las pantallas basado en la actividad, permitiendo el crecimiento de copia única de la estabilidad con la subsiguiente inducción de aumento de la actividad.
El sustrato de 2,4-DNP-Cellobioside utilizados en nuestra pantalla no está disponible en el mercado de los proveedores, pero sustratos similares se pueden comprar. Sigma-Aldrich ofrece 2-nitrofenil (Cat. N º N4764) y 4-nitrofenil (Cat. N º N5759) cellobiosides. La pantalla general que se describe podría llevarse a cabo con estos sustratos, pero algunas modificaciones serían necesarias. Estos fenoles mono-sustituidos tienen mayores valores de pKa, alrededor de 7,2, en comparación con el DNP, el cual es de alrededor de 4. El pH óptimo para la actividad de celulasa se ha informado en un rango de pH 4,5 a 6,0 14, 15. El uso de DNP-C permite que el ensayo se llevará a cabo en condiciones de pH óptimo, lo que facilita la identificación de las celulasas. Además, el glucósido di-sustituido es mucho más reactivo que los otros, lo que permite la detección de más reacios celulasas. Por lo tanto, el uso de DNP-cellobioside ha permitido una pantalla más robusta y sensible que estará disponible con los sustratos comerciales.
Es de destacar que esta pantalla se puede utilizar para la detección de cualquier enzima con un sustrato colorimétrico asociado o fluorométricos. Celulasas son una enzima estable y activa, ideal para el desarrollo inicial y la optimización de los parámetros de detección. El enfoque general que aquí se presenta es una poderosa herramienta para la detección de las bibliotecas de metagenómica para aplicaciones industriales y académicos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Steve Withers y Chen Hong-Ming para proporcionar DNP-Cellobioside sustrato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | |
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | |
| Varioskan | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| RapidStak | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Connected to Varioskan | |
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 100mg/mL in water |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | In TE buffer solution, 100mM |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | In TE buffer solution, 10mM |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 |
References
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