Summary
Este protocolo descreve um ecrã de alta taxa de transferência para a atividade celulolítica de uma biblioteca metagenomic expressa em Escherichia coli. A tela é solução baseada e altamente automatizado, e usa um pot-química em 384 microplacas bem com a leitura final como uma medida de absorbância.
Abstract
Celulose, a mais abundante fonte de carbono orgânico no planeta, tem amplas aplicações industriais, com ênfase crescente na produção de biocombustíveis 1. Métodos químicos para modificar ou degradar a celulose normalmente requerem ácidos fortes e altas temperaturas. Como tal, métodos enzimáticos tornaram-se proeminentes no processo de bioconversão. Enquanto a identificação de celulases ativa a partir de isolados de bactérias e fungos tem sido pouco eficaz, a grande maioria dos micróbios na natureza resistir cultivo de laboratório. Genômica ambiental, também conhecida como screening metagenomic abordagens, têm uma grande promessa para fazer a ponte de cultivo na busca de enzimas bioconversão romance. Abordagens triagem metagenomic com sucesso recuperado celulases romance de ambientes tão variados quanto os solos 2, 3 e rúmen de búfalo da região posterior do intestino de cupins 4 usando placas de carboximetilcelulose (CMC) agar coradas com corante vermelho congo (com base no método de Teather e Wood 5). No entanto, o método CMC é limitada em débito, não é quantitativa e manifesta um baixo sinal-ruído 6. Outros métodos têm sido relatados 7,8, mas cada um usa ensaio agar plate-based, o que é indesejável para high-throughput screening de bibliotecas genômicas grande inserção. Aqui nós apresentamos uma solução baseada em tela para a atividade celulase utilizando um dinitrofenol cromogênico (DNP)-cellobioside substrato 9. Nossa biblioteca foi clonado no controle de cópia pCC1 fosmid para aumentar a sensibilidade do ensaio através da indução no número de cópias 10. O método usa um pot-química em 384 poços microplacas com a leitura final, fornecida como uma medida de absorbância. Essa leitura é quantitativa, sensíveis e automatizados com um caudal de até 100X placas de 384 poços por dia, utilizando um manipulador de líquidos e leitor de placas com sistema de empilhamento em anexo.
Protocol
Antes de iniciar este protocolo, você terá sua biblioteca metagenomic armazenados em um formato placa 384 poços. Em nosso estudo, foi utilizada a pCC1 vetor de controle de cópia fosmid em combinação com TransforMax fago T1-resistentes EPI300-T1 R E. células de Escherichia como o anfitrião da biblioteca e armazenadas nossas placas a -80 ° C 11.
1. Replicação das Placas Biblioteca metagenomic
- Descongele as placas contendo sua biblioteca a 37 ° C por aproximadamente 20 minutos, ou até que todos os poços são descongelados.
- Use o recurso de luz ultravioleta de esterilização da qPix2 para esterilizar o robô por 15 minutos.
- Prepare o caldo LB com cloranfenicol na concentração final de 12.5ug/mL e arabinose em 100ug/mL em um frasco de reagente 500mL. Cada placa usará cerca de 20 mL, além de fazer uma 50mL adicionais para permitir volume morto.
- Configure o qFill3 como instruções do fabricante com a garrafa media ligados ao colector através do tubo estéril. Programá-lo para a quantidade adequada de mídia, e configurá-lo para preencher um volume de 45uL em cada poço.
- Purgar o ar da tubulação e múltiplas usando o recurso de purga do robô até que a mídia é visível proveniente de cada pino da placa base.
- Preencher o número desejado de placas com a mídia usando o LB qFill3. Cada prato leva aproximadamente 20 segundos para encher.
- Carregar as placas biblioteca e as placas novas em áreas apropriadas do robô qPix2. Preencha os banhos de limpeza com os reagentes adequados; 2% Micro90 no banho traseira, autoclavado água destilada em banho de meio, 80% de etanol na banheira frente.
- Use o programa "Replicar" do qPix2. No software, selecione o apropriado cabeça, número e tipos de placas e chapas de fonte de destino. Também configurar a cabeça para limpar entre repetições, geralmente 6 ciclos em cada banho é suficiente. Capacidade da máquina é de 10 placas de cada vez, e leva aproximadamente 15 minutos para replicar todas elas com uma cabeça de alfinete 384 (ou cerca de 50 minutos com uma cabeça de alfinete 96).
Nota: Existe uma opção para "Stir Source" ou "Stir Destino". É recomendado não usar essas opções como problemas já ocorreu com o nosso robot usá-los. - Uma vez que as placas são replicadas, crescem as placas a 37 ° C por 24 horas em uma caixa de umidade. Porque estamos induzindo a um número elevado de cópias de fosmid com adição de arabinose, os clones tendem a crescer mais lentamente do que os não-induzida clones. Retorno das placas biblioteca para -80 ° C.
Nota: Incubação em uma caixa de umidade garante a evaporação dos meios de comunicação não ocorrer nos poços na borda das placas, mantendo um ambiente uniforme para todos os poços. - Limpe o robô qFill3 pela primeira purga-lo com água (~ 50 ml) e, em seguida, o etanol 80% (~ 50 ml). Desmontar os componentes, e limpo e autoclave a garrafa, tampa, e tubo enrolado em folha de alumínio.
2. Medir o Crescimento da E. Clones coli
- Remover placas de 37 ° C incubadora. Retire e reserve as tampas, e placas de lugar para a plataforma de carregamento revista fornecido com o RapidStak, até um máximo de 25 placas.
Nota: A placa na parte inferior da pilha será o primeiro a ser lido. Certifique-se de acompanhar a ordem das placas, como o software não registra isso. - Remover uma revista da Stak Rapid, garantir que ele está vazio, e empurre-o para a pilha de pratos para ser lido. Agarrá-lo pela alça, e as placas devem todos ser carregados na revista. Carregar a revista no RapidStak.
Nota: A revista tem um pequeno parafuso no canto denotando que canto os poços A1 das placas deve ir. A revista só vai montar na RapidStak em uma orientação. - Abra o programa RE SkanIt no computador ligado às máquinas. Selecionar "New Session" e nomeá-la adequadamente. Escolha "Fundo Plano Corning 384-placa bem" como o tipo de prato.
- Na "Placa Layout" da área, selecione a opção "Wizard" botão, e escolhê-lo para adicionar 384 incógnitas para seu prato.
- No "Protocolo", selecione o "Bem Loop" opção, e entrar para 384 poços. A "Bem Loop" ícone aparecerá no fluxo de árvore no lado esquerdo da tela. Selecione o ícone e clique para adicionar "Medição fotométrica". Configurá-lo para ler em 600nm.
- Salve o seu protocolo com um nome único, e feche o programa RE SkanIt.
- No computador, abra o programa PolaraRS.
- Na página principal, haverá tabela listando os instrumentos conectado ao dispositivo RapidStak. O VarioSkan deve ser no lado esquerdo desta tabela. Sob o título VarioSkan, haverá dois links; "RunSession" e "Incubar". Clique no botão "RunSession" opção.
- Uma nova janela, a janela de teste, aparecerá com um fluxograma no meio. Selecione a opção "RunSession" item (deve ser o item presente apenas). No lado direito da tela um menu drop-downirá aparecer. Encontrar o nome do seu RE SkanIt salvo executar neste menu.
Nota: Parece haver qualquer ordenamento racional para esse menu. Não é por ordem alfabética, ou por data de adição, ou relacionado ao local onde o computador do protocolo é salvo. Isto significa que você deve olhar através de todos os protocolos antes de encontrar o seu próprio, que é uma dor. - Uma vez selecionado o protocolo, no canto superior direito clique em "Executar este ensaio".
- Uma caixa irá aparecer, pedindo-lhe para indicar que a revista para usar como fonte, e que a revista está vazio. Caixa inferior na tela corresponde à revista da frente. [Opcional: ele pede que você digite o número de placas carregadas para determinar uma estimativa para a quantidade de tempo que levará. Esta estimativa é normalmente muito longe.]
- Garantir tanto a RapidStak eo VarioSkan estão ligados, e pressione "OK".
- O RapidStak irá carregar automaticamente suas placas para o leitor de placas, permitindo medições contínuas de chapas. Para ler 25 placas leva aproximadamente 50 minutos.
Nota: Recomenda-se observar o carregamento primeira placa na VarioSkan para garantir o alinhamento correcto das máquinas. Se o RapidStak não carrega o leitor de placas corretamente, utilize o "Pause este ensaio" botão no canto superior direito da janela PolaraRS. - Uma vez que o VarioSkan é feito de ler todos os pratos, retire o carregador cheio e colocá-lo na plataforma de carga revista. Levante o retângulo externo da plataforma, ea revista deve deslizar, deixando as placas de pé em uma pilha no meio. Substituir as tampas para as placas apropriadas.
3. Além do Mix Ensaio para Cada Placa
- Preparar a mistura de ensaio usando o estoque 10x premade da mistura de lise (10% Triton X-100, ris 100mM, EDTA 10mM) em tampão acetato de potássio 50 mM pH 5,5. Prepare um estoque de até 75mg/mL substrato DNP cellobioside em DMSO, certificando-se o substrato estiver completamente dissolvido. Adicionar DNP-cellobioside solução estoque de misturar ensaio para uma concentração final de 0.1mg/mL. Cada placa usará cerca de 20 mL de solução, além de fazer uma 50mL adicionais para permitir volume morto.
Nota: DNP Cellobioside não é facilmente solúvel em água, de modo a dissolução em DMSO aumenta a solubilidade. A presença de DMSO na solução final do ensaio não tem nenhum efeito observável. - Configure o qFill3 como instruções do fabricante com a garrafa media ligados ao colector através do tubo estéril. Programá-lo para a quantidade adequada de mídia, e configurá-lo para preencher um volume de 45uL em cada poço.
- Purgar o ar da tubulação e múltiplas usando o recurso de purga do robô até que a mídia é visível proveniente de cada pino da placa base.
- Adicione a mistura de ensaio para cada placa usando o qFill3. Cada prato leva aproximadamente 20 segundos para encher.
- Uma vez mix de ensaio é adicionada, incubar as placas a 37 ° C em uma caixa de umidade para 12-16 horas.
Nota: Mais de incubação das placas uma vez que o mix de ensaio é adicionada fará com que a evaporação nos poços externa da placa, produzindo valores mais elevados de absorbância do que o observado para os poços no interior. Isso pode ser compensado por placas de incubação em câmara úmida.
4. Absorbância leitura de Clones Analisada
- Remover placas de 37 ° C incubadora. Retire e reserve as tampas, e placas de lugar para a plataforma de carregamento revista fornecido com o RapidStak, até um máximo de 25 placas.
Nota: A placa na parte inferior da pilha será o primeiro a ser lido. Certifique-se de acompanhar a ordem das placas, como o software não registra isso. - Remover uma revista da Stak Rapid, garantir que ele está vazio, e empurre-o para a pilha de pratos para ser lido. Agarrá-lo pela alça, e as placas devem todos ser carregados na revista. Carregar a revista no RapidStak.
Nota: A revista tem um pequeno parafuso no canto denotando que canto os poços A1 das placas deve ir. A revista só vai montar na RapidStak em uma orientação. - Abra o programa RE SkanIt no computador ligado às máquinas. Selecionar "New Session" e nomeá-la adequadamente. Escolha "Fundo Plano Corning 384-placa bem" como o tipo de prato.
- Na "Placa Layout" da área, selecione a opção "Wizard" botão, e escolhê-lo para adicionar 384 incógnitas para seu prato.
- No "Protocolo", selecione o "Bem Loop" opção, e entrar para 384 poços. A "Bem Loop" ícone aparecerá no fluxo de árvore no lado esquerdo da tela. Selecione o ícone e clique para adicionar "Medição fotométrica". Configurá-lo para ler em 400nm.
- Salve o seu protocolo com um nome único, e feche o programa RE SkanIt.
- No computador, abra o programa PolaraRS.
- Na página principal, haverá tabela listando os instrumentos conectado ao dispositivo RapidStak. O VarioSkan deve ser no lado esquerdo desta tabela. Sob o título VarioSkan, haverá dois links; "RunSession" e "Incubate ". Clique no botão" RunSession opção ".
- Uma nova janela, a janela de teste, aparecerá com um fluxograma no meio. Selecione a opção "RunSession" item (deve ser o item presente apenas). No lado direito da tela um menu drop-down aparecerá. Encontrar o nome do seu RE SkanIt salvo executar neste menu.
- Uma vez selecionado o protocolo, no canto superior direito clique em "Executar este ensaio".
- Uma caixa irá aparecer, pedindo-lhe para indicar que a revista para usar como fonte, e que a revista está vazio. Caixa inferior na tela corresponde à revista da frente. [Opcional: ele pede que você digite o número de placas carregadas para determinar uma estimativa para a quantidade de tempo que levará. Esta estimativa é normalmente muito longe.]
- Garantir tanto a RapidStak eo VarioSkan estão ligados, e pressione "OK"
- O RapidStak irá carregar automaticamente suas placas para o leitor de placas, permitindo medições contínuas de chapas.
Nota: Recomenda-se observar o carregamento primeira placa na VarioSkan para garantir o alinhamento correcto das máquinas. Se o RapidStak não carrega o leitor de placas corretamente, utilize o "Pause este ensaio" botão no canto superior direito da janela PolaraRS. - Uma vez que o VarioSkan é feito de ler todos os pratos, retire o carregador cheio e colocá-lo na plataforma de carga revista. Levante o retângulo externo da plataforma, ea revista deve deslizar, deixando as placas de pé em uma pilha no meio. As placas podem ser eliminadas de acordo com seus procedimentos de laboratório.
- Para exportar as leituras de absorbância, software open RE SkanIt, e escolha "Abrir um arquivo existente".
- Selecione o diretório onde você salvou a sua sessão, bateu o ícone "+" para expandir a lista e sob o título rubrica será opções rotuladas "Container 1" para "Container N", dependendo do número de placas. Selecione a primeira placa a ser analisado.
- Na barra de menu no topo da página, selecione "Processamento de Dados> Relatório / Export"
- Escolha as opções desejadas para a exportação.
Nota: Eu normalmente selecione "Layout da placa" e "fotométrica" dados para a exportação. - Clique em "Exibir relatório" e depois "File> Save". Escolha o diretório desejado. O formato de saída é uma planilha do Microsoft Excel
5. Resultados representante
Um exemplo de leituras de absorbância de uma placa de 384 único poço que contém um clone positivo é mostrado na Figura 2. Clones positivos mostram um acentuado aumento na absorvância sobre aqueles que não expressam a atividade celulase. Diferenças no tempo de ensaio, local bem no prato, ou concentração DNP (pode ser introduzido através da filtragem de não-dissolvido DNP) pode afetar as leituras de absorbância absoluta. Leituras de absorbância relativa, como a diferença de absorvância acima da média ou média placa de coluna, são um método mais robusto de identificar clones celulase positivo.
Após a identificação dos clones positivos das placas biblioteca, recomenda-se a replicar todos os clones positivos para um novo prato para a triagem secundária. Isso elimina os efeitos decorrentes da variação local bem ou placa e permite uma maior comparação direta entre clones positivos.
Figura 1. Fluxograma do ensaio de alto rendimento para uma biblioteca metagenomic clonado em E. coli e armazenadas a -80 ° C.
Figura 2. Leituras de absorbância de uma placa de 384 poços contendo um clone positivo. Celulase clones positivos podem ser identificados por absorbância aumentou significativamente ao longo clones negativo.
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Discussion
Uma tela de alto rendimento para a detecção rápida da atividade celulolítica de uma biblioteca genômica inserir grandes metagenomic DNA expressa em E. coli é descrita neste protocolo. Este método é uma melhoria em relação ao ensaio de Red CMC / Congo comumente utilizados na literatura. É solução baseada, e permite um pot-triagem química em 384 poços pratos, com o resultado final como leituras de absorbância de um leitor de placas permitindo a análise quantitativa. A automação de cada etapa deste processo permite a triagem sem supervisão de mais de 25 placas de 384 poços por hora. Os dados podem ser facilmente exportados a partir do software em uma planilha do Microsoft Excel, permitindo a análise ou processamento por software de terceiros.
Uma limitação deste ensaio existe no potencial de expressão de proteínas exógenas em E. anfitrião coli. Uma biblioteca metagenomic contém DNA de muitos organismos diferentes, apenas um subconjunto do que pode ser reconhecido pelo E. coli transcrição / máquinas de tradução. Mesmo quando expressa, produtos de genes exógenos pode não alcançar a funcionalidade devido a dobrar imprópria, processamento, ou níveis de expressão inadequada. Essas limitações podem ser parcialmente compensados através da utilização de sistemas de controle de cópia, como visto em anteriores estudos funcionais triagem metagenomic. 12. O controle de cópia pCC1 fosmid usado aqui permite a indução através da adição do indutor L-arabinose, e aumenta o número de cópias de um, para até 100 cópias por célula 13. Estes sistemas podem melhorar o resultado de telas baseado em atividades, permitindo o crescimento cópia única para a estabilidade com a indução subseqüente para o aumento da atividade.
O substrato 2,4-DNP Cellobioside usado em nossa tela não está disponível comercialmente a partir de fornecedores, mas substratos semelhantes podem ser comprados. Sigma-Aldrich oferece 2-nitrofenil (Cat. N4764) e 4-nitrofenil (Cat. N5759) cellobiosides. A tela gerais descritos poderiam ser realizadas com esses substratos, mas algumas modificações seriam necessárias. Estes fenóis mono-substituídas têm valores mais elevados pKa, em torno de 7,2, em comparação com DNP, que é em torno de 4. PH ótimo para atividade da celulase foi relatada na faixa de pH 4,5-6,0 14, 15. O uso de DNP-C permite que a prova seja realizada em condições de pH ideal, permitindo a fácil identificação de celulases. Além disso, o glicosídeo di-substituído é muito mais reativa do que os outros, permitindo a detecção de celulases mais relutante. Assim, o uso de DNP-cellobioside tem permitido para uma tela mais robusto e sensível do que estaria disponível com substratos comerciais.
É notável que esta tela pode ser usado para a detecção de qualquer enzimas com um substrato colorimétrico associado ou fluorimétrico. Celulases são uma enzima estável e ativa, ideal para o desenvolvimento inicial e otimização dos parâmetros de triagem. A abordagem geral aqui apresentada é uma poderosa ferramenta para a triagem de bibliotecas metagenomic tanto para aplicações acadêmicas e industriais.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Steve Withers e Hong-Ming Chen para a prestação de DNP Cellobioside-substrato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | |
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | |
| Varioskan | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| RapidStak | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Connected to Varioskan | |
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 100mg/mL in water |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | In TE buffer solution, 100mM |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | In TE buffer solution, 10mM |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 |
References
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