Summary
Detta protokoll beskriver en hög genomströmning skärm för cellulolytic aktivitet från en metagenomic bibliotek uttryckt i Escherichia coli. Skärmen är baserad och högt automatiserad, och använder ett-gryta kemi i 384 väl mikroplattor med den slutliga avläsningen som en absorbans mätning.
Abstract
Cellulosa, den rikligaste källan till organiskt kol på planeten, har omfattande industriella applikationer med ökad betoning på produktion av biobränslen 1. Kemiska metoder för att ändra eller försämra cellulosa kräver normalt starka syror och höga temperaturer. Som sådan har enzymatiska metoder blivit framstående i interkonversion processen. Medan identifiering av aktiva cellulaser från bakterier och svampar isolat har ganska effektiva, de allra flesta av mikrober i naturen motstå laboratorium odling. Miljö-genomiska, även känd som metagenomic, screening metoder har mycket lovande för att överbrygga odling klyftan i sökandet efter nya interkonversion enzymer. Metagenomic screening metoder har framgångsrikt återhämtat roman cellulaser från miljöer så varierande som mark 2, buffel våmmen 3 och termiter hind-gut 4 med hjälp av karboxymetylcellulosa (CMC) plattor agar målat med Kongo röd färg (baserat på metoden för Teather och trä 5). Är dock CMC-metoden begränsad kapacitet, inte är kvantitativ och manifesterar ett lågt signal-brus-förhållande 6. Andra metoder har rapporterats 7,8 men varje använd en agarplatta-baserad analys, vilket är olämpligt för high-throughput screening av stora bibliotek sätta genomisk. Här presenterar vi en lösning baserad skärm för cellulas aktivitet med hjälp av ett kromogent dinitrofenol (DNP)-cellobioside substrat 9. Vårt bibliotek klonade in i pCC1 Copy Control fosmid att öka analysens känslighet genom kopierings antal induktion 10. Metoden använder ett-gryta kemi i 384-brunnars mikroplattor med den slutliga avläsningen tillhandahålls som en absorbans mätning. Denna avläsning är kvantitativ, känslig och automatiserad med en genomströmning på upp till 100X 384-brunnars plattor per dag med hjälp av en vätska handler och plattläsaren med bifogade stapla system.
Protocol
Innan du börjar detta protokoll behöver du ditt metagenomic biblioteket förvaras i 384 brunnar format. I vår studie använde vi pCC1 Copy Control fosmid vektor i kombination med fag T1-resistenta TransforMax EPI300-T1 R E. coli-celler som biblioteket värd och lagras våra tallrikar vid -80 ° C 11.
1. Replikering av Metagenomic biblioteket Plattor
- Avfrostning plattorna innehåller biblioteket vid 37 ° C i ca 20 minuter, eller tills alla brunnar tinats.
- Använd UV-ljus sterilisering funktionen på qPix2 att sterilisera roboten i 15 minuter.
- Förbered LB buljong med kloramfenikol vid en slutlig koncentration av 12.5ug/mL och arabinos på 100ug/mL i en 500 ml reagens flaska. Varje platta kommer att använda ungefär 20ml, plus göra en extra 50mL att möjliggöra dödvolym.
- Ställ in qFill3 enligt tillverkarens anvisningar med media flaskan knutna till grenröret via sterila slangen. Programmera den för lämplig mängd medier, och ställ in den för att fylla en 45uL volym i varje brunn.
- Rensa luften från slangen och grenröret med utrensning inslag av roboten tills medierna är synligt från varje stift i fördelaren.
- Fyll önskat antal plattor med LB medier använder qFill3. Varje platta tar ungefär 20 sekunder att fylla.
- Ladda biblioteket tallrikar och den färska plattor i lämpliga områden av qPix2 roboten. Fyll reningsbad med lämpliga reagenser, 2% Micro90 i den bakre bad, autoklaveras destillerat vatten i mitten badet, 80% etanol i fronten badet.
- Använd "Replikera" program qPix2. I programmet, välj lämplig huvudet, antal och typer av källor plattor och plattor destination. Också ställa in huvudet för att rengöra mellan replikationer, vanligen 6 cykler i varje bad är nog. Kapaciteten på maskinen är 10 plattor åt gången, och det tar cirka 15 minuter att kopiera dem alla med en 384-pin huvudet (eller cirka 50 minuter med en 96-pin huvud).
OBS: Det finns en möjlighet att "Rör Källa" eller "Rör Destination". Det rekommenderas att inte använda dessa alternativ som problem har tidigare skett med vår robot använder dem. - När plattorna är replikeras, växa plattorna vid 37 ° C i 24 timmar i en fukt låda. Eftersom vi är förorsakar en hög Antal kopior av fosmid med tillägg av arabinos, klonerna tenderar att växa långsammare än icke-inducerad kloner. Återgå biblioteket plattorna till -80 ° C.
OBS: inkubation i en luftfuktighet låda garanterar avdunstning av media inte förekommer i brunnarna på kanten av plattorna, som en enhetlig miljö för alla brunnar. - Rengör qFill3 roboten genom att först rensa den med vatten (~ 50mL) och sedan 80% etanol (~ 50mL). Demontera komponenter och ren och autoklav flaskan, lock och slangar insvept i aluminiumfolie.
2. Att mäta tillväxten av E. coli Clones
- Ta bort plattor från 37 ° C inkubator. Ta ut och ställ åt sidan locken och tallrikar placera på tidningen flaket medföljer RapidStak, upp till maximalt 25 plattor.
Obs: Plattan i botten av högen kommer att bli den första att läsas. Se till att hålla reda på ordningen på plattor, eftersom mjukvaran inte redovisa detta. - Ta en tidning från Rapid Stak, se till att den är tom, och skjut det på högen med plattor som ska läsas. Ta det i handtaget, och plattorna bör alla laddas i magasinet. Ladda magasinet i RapidStak.
Obs: Tidningen har en liten skruv i hörnet som anger vilket hörn A1 brunnar av plattorna ska gå. Tidningen kommer bara att montera i RapidStak i en riktning. - Öppna programmet SkanIt RE på datorn ansluten till maskiner. Välj "Ny session" och den ett lämpligt namn. Välj "Corning plan botten 384-brunnar" som plattan typ.
- I "tavla Layout" väljer "wizard"-knappen och välj den för att lägga 384 okända till din tallrik.
- I "Protokoll" väljer att "Tja Loop" alternativet och ange för 384 brunnar. En "Tja Loop"-ikonen visas i flödes-trädet på vänster sida av skärmen. Välj ikonen och klickar för att lägga till "Fotometrisk mätning". Ställ in den att läsa på 600 Nm.
- Spara dina protokoll med ett unikt namn och stäng SkanIt RE-programmet.
- På datorn, öppna PolaraRS programmet.
- På huvudsidan kommer det att finnas tabell med de instrument som är anslutna till RapidStak enhet. Den VarioSkan ska vara på vänster sida av denna tabell. Under VarioSkan rubriken kommer det att finnas två länkar, "RunSession" och "Odla". Klicka på "RunSession" alternativet.
- Ett nytt fönster, analysen fönster visas med ett flödesschema i mitten. Välj "RunSession" objekt (det borde vara det enda objektet finns). På höger sida av skärmen en rullgardinsmenyvisas. Hitta namnet på din sparade SkanIt RE köra i denna meny.
OBS: Det verkar inte finnas någon rationell beställning till denna meny. Det är inte bokstavsordning, eller datum, eller relaterade till var på datorn protokollet sparas. Det betyder att du måste titta igenom alla protokoll innan du hitta din egen, vilket är en smärta. - När du valt din protokoll, i övre högra hörnet klickar du på "Kör det här testet."
- En ruta dyker upp och ber dig att beteckna vilken tidning som ska användas som källa, och som tidningen är tom. Den nedre rutan på skärmen motsvarar fronten tidningen. [Tillval: Det ber dig att ange antalet plattor lastas för att avgöra en uppskattning för den tid det tar. Denna uppskattning är normalt långt borta.]
- Se till att både RapidStak och VarioSkan är påslagna, och tryck på "OK".
- Den RapidStak kommer automatiskt ladda dina tallrikar i plattläsaren, vilket möjliggör kontinuerliga mätningar av plattor. För att läsa 25 tallrikar tar ungefär 50 minuter.
Observera: Det rekommenderas att följa den första plattan fylls på i den VarioSkan att säkerställa en korrekt anpassning av maskinerna. Om RapidStak inte laddar plattläsaren ordentligt, använda "Pause denna analys"-knappen i övre högra hörnet av PolaraRS fönster. - När VarioSkan är gjort läsa alla plattorna, ta bort hela magasinet och placera den på tidningen flak. Lyft upp den yttre rektangeln av plattformen, och tidningen ska glida av och lämnar plattorna stående i en hög i mitten. Byt ut locken till lämplig plattorna.
3. Tillägg av analysen Mix varje platta
- Förbered analysen blanda med premade 10x lager av lys blandning (10% Triton X-100, 100mm RIS, 10 mM EDTA) i 50 mM kalium acetatbuffert vid pH 5,5. Förbered ett lager på upp till 75mg/mL DNP-cellobioside substrat i DMSO och se till att underlaget är helt upplöst. Lägg till DNP-cellobioside stamlösningen till analys blanda till en slutlig koncentration av 0.1mg/mL. Varje platta kommer att använda ungefär 20ml lösning, plus göra en extra 50mL att möjliggöra dödvolym.
Notera: DNP-Cellobioside är svårlösligt i vatten, så löses i DMSO ökar lösligheten. Förekomsten av DMSO i den slutliga analysen lösningen har några observerbara effekter. - Ställ in qFill3 enligt tillverkarens anvisningar med media flaskan knutna till grenröret via sterila slangen. Programmera den för lämplig mängd medier, och ställ in den för att fylla en 45uL volym i varje brunn.
- Rensa luften från slangen och grenröret med utrensning inslag av roboten tills medierna är synligt från varje stift i fördelaren.
- Lägg analys mix till varje platta med qFill3. Varje platta tar ungefär 20 sekunder att fylla.
- När analysen blandning tillsätts Inkubera plattorna vid 37 ° C i en luftfuktighet box för 12-16 timmar.
OBS: Över-inkubation av plattor när analysen blandningen läggs kommer att orsaka förångning i den yttre brunnar i plattan, vilket ger högre absorbansen än sett insidan brunnar. Detta kan kompenseras genom inkubering plattorna i en fuktig kammare.
4. Läsning Absorbans av analyserad Clones
- Ta bort plattor från 37 ° C inkubator. Ta ut och ställ åt sidan locken och tallrikar placera på tidningen flaket medföljer RapidStak, upp till maximalt 25 plattor.
Obs: Plattan i botten av högen kommer att bli den första att läsas. Se till att hålla reda på ordningen på plattor, eftersom mjukvaran inte redovisa detta. - Ta en tidning från Rapid Stak, se till att den är tom, och skjut det på högen med plattor som ska läsas. Ta det i handtaget, och plattorna bör alla laddas i magasinet. Ladda magasinet i RapidStak.
Obs: Tidningen har en liten skruv i hörnet som anger vilket hörn A1 brunnar av plattorna ska gå. Tidningen kommer bara att montera i RapidStak i en riktning. - Öppna programmet SkanIt RE på datorn ansluten till maskiner. Välj "Ny session" och den ett lämpligt namn. Välj "Corning plan botten 384-brunnar" som plattan typ.
- I "tavla Layout" väljer "wizard"-knappen och välj den för att lägga 384 okända till din tallrik.
- I "Protokoll" väljer att "Tja Loop" alternativet och ange för 384 brunnar. En "Tja Loop"-ikonen visas i flödes-trädet på vänster sida av skärmen. Välj ikonen och klickar för att lägga till "Fotometrisk mätning". Ställ in den att läsa på 400nm.
- Spara dina protokoll med ett unikt namn och stäng SkanIt RE-programmet.
- På datorn, öppna PolaraRS programmet.
- På huvudsidan kommer det att finnas tabell med de instrument som är anslutna till RapidStak enhet. Den VarioSkan ska vara på vänster sida av denna tabell. Under VarioSkan rubriken kommer det att finnas två länkar, "RunSession" och "Incubate ". Klicka på" RunSession "alternativet.
- Ett nytt fönster, analysen fönster visas med ett flödesschema i mitten. Välj "RunSession" objekt (det borde vara det enda objektet finns). På höger sida av skärmen en rullgardinsmeny visas. Hitta namnet på din sparade SkanIt RE köra i denna meny.
- När du valt din protokoll, i övre högra hörnet klickar du på "Kör det här testet."
- En ruta dyker upp och ber dig att beteckna vilken tidning som ska användas som källa, och som tidningen är tom. Den nedre rutan på skärmen motsvarar fronten tidningen. [Tillval: Det ber dig att ange antalet plattor lastas för att avgöra en uppskattning för den tid det tar. Denna uppskattning är normalt långt borta.]
- Se till att både RapidStak och VarioSkan är påslagna, och tryck på "OK"
- Den RapidStak kommer automatiskt ladda dina tallrikar i plattläsaren, vilket möjliggör kontinuerliga mätningar av plattor.
Observera: Det rekommenderas att följa den första plattan fylls på i den VarioSkan att säkerställa en korrekt anpassning av maskinerna. Om RapidStak inte laddar plattläsaren ordentligt, använda "Pause denna analys"-knappen i övre högra hörnet av PolaraRS fönster. - När VarioSkan är gjort läsa alla plattorna, ta bort hela magasinet och placera den på tidningen flak. Lyft upp den yttre rektangeln av plattformen, och tidningen ska glida av och lämnar plattorna stående i en hög i mitten. Plattorna kan deponeras enligt dina lab rutiner.
- För att exportera absorbansen, öppna SkanIt RE programmet och välj "Öppna en befintlig fil".
- Välj den katalog där du sparade din session, tryck på "+" ikonen för att utöka listan och under titeln rubrik kommer att alternativen märkt med "Container 1" till "Container N" beroende på antalet plattor. Välj den första plattan som ska analyseras.
- I menyn längst upp på sidan, välj "Data Processing> Rapport / Export"
- Välj de alternativ som önskas för export.
OBS: Jag brukar välja "tavla Layout" och "Fotometrisk" data för export. - Klicka på "Visa rapport" och sedan "Arkiv> Spara". Välj önskad katalog. Utgången formatet är ett Microsoft Excel-kalkylblad
5. Representativa resultat
Ett exempel på absorbansen från ett enda 384 brunnar som innehåller en positiv klon visas i figur 2. Positiva kloner visar en markant ökning i absorbans över de som inte uttrycker cellulas aktivitet. Skillnader i analysen tid, och plats på tallriken, eller DNP koncentration (kan införas genom att filtrera bort icke-upplöst DNP) kan påverka absolut absorbansmätningar. Relativ absorbans avläsningar, till exempel skillnaden i absorbans över plattan genomsnittlig eller kolumn genomsnitt är ett mer robust metod för att identifiera cellulas positiva kloner.
Efter identifiering av positiva kloner från biblioteket plattor, rekommenderas det att replikera alla positiva kloner i en ny plåt för sekundär screening. Detta eliminerar effekterna av såväl plats eller plåt variation och möjliggör mer direkt jämförelse mellan positiva kloner.
Figur 1. Flödesschema för hög genomströmning assay för en metagenomic bibliotek klonad i E. coli och förvaras vid -80 ° C.
Figur 2. Absorbans avläsningar från ett 384-brunnars platta innehåller en positiv klon. Cellulas positiva kloner kan identifieras genom betydligt högre absorbans över negativa kloner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En hög genomströmning skärm för snabb detektion av cellulolytic aktivitet från ett stort in arvsmassans DNA metagenomic bibliotek uttrycks i E. coli beskrivs i detta protokoll. Denna metod är en förbättring jämfört med CMC / Congo Red analys som ofta används i litteraturen. Den är baserad, och tillåter ett-gryta kemi screening i 384-brunnars plattor, med den sista produktionen som absorbans avläsningar från ett plattläsaren möjliggör kvantitativ analys. Automatisering av varje steg i denna process möjliggör oövervakad screening av mer än 25 384 brunnar plåtar per timme. Informationen kan enkelt exporteras från programmet till ett Microsoft Excel kalkylblad, vilket möjliggör analys eller bearbetning av tredje parts programvara.
En begränsning av detta test finns i uttrycket potential exogena proteiner i E. coli värd. En metagenomic bibliotek innehåller DNA från många olika organismer, kan endast en delmängd av, som erkänns av E. coli transkription / översättning maskiner. Även när uttryckt kan exogena genprodukter inte uppnå funktionalitet på grund av felaktig falsning, bearbetning eller otillräckliga nivåer uttryck. Dessa begränsningar kan delvis kompenseras genom utnyttjande av system kopia kontroll, som sett i tidigare funktionella metagenomic screening studier. 12. Den pCC1 Copy Control fosmid används här gör induktion genom tillägg av inducerare L-arabinos, och ökar kopiera nummer från ett till upp till 100 kopior per cell 13. Dessa system kan förbättra utfallet av verksamheten baserad skärmar genom att aktivera enda exemplar tillväxt för stabilitet med efterföljande induktion för ökad aktivitet.
Underlaget 2,4-DNP-Cellobioside som används i våra skärmen är inte kommersiellt tillgänglig från leverantörer, men liknande substrat kan köpas. Sigma-Aldrich erbjuder 2-nitrofenyl (Cat nr N4764) och 4-nitrofenyl (Cat nr N5759) cellobiosides. Den allmänna skärmen som beskrivs skulle kunna genomföras med dessa substrat, men vissa modifieringar skulle krävas. Dessa mono-substituerade fenoler har högre pKa-värden runt 7,2, jämfört med DNP, vilket är cirka 4. Optimalt pH för cellulas aktivitet har rapporterats variera mellan pH 4,5-6,0 14, 15. Användningen av DNP-C gör att analysen skall utföras på optimal pH-förhållanden, vilket gör det enklare att identifiera cellulaser. Dessutom är di-substituerade glycoside mycket mer reaktiva än de andra, gör det möjligt att upptäcka mer motvilliga cellulaser. Således har användningen av DNP-cellobioside tillåtet för en mer robust och känslig skärm än skulle vara tillgängliga med kommersiella substrat.
Det är anmärkningsvärt att den här skärmen kan användas för detektion av enzymer med en tillhörande kolorimetriska eller fluorometriska substrat. Cellulaser är en stabil och aktivt enzym, perfekt för den inledande utvecklingen och optimering av screening parametrar. Det allmänna tillvägagångssättet som presenteras här är ett kraftfullt verktyg för screening av metagenomic bibliotek för både akademiska och industriella applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Steve manken och Hong-Ming Chen för att ge DNP-Cellobioside substrat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | |
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | |
| Varioskan | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| RapidStak | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Connected to Varioskan | |
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 100mg/mL in water |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | In TE buffer solution, 100mM |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | In TE buffer solution, 10mM |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 |
References
- Rubin, E. M. Genomics of cellulosic biofuels. Nature. 454, 841-845 (2008).
- Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase. J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).
- Duan, C. J. Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens. J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).
- Zhang, Y. H. P. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Sharrock, K. R. Cellulase assay methods: a review. J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).
- Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine. Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).
- Huang, J. S., Tang, J. Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).
- Tull, D., Withers, S. G. Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi. Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).
- Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. PNAS. 104, 5590-5595 (2007).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J Vis Exp. , (2009).
- Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).
- Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).
- Johnson, E. A. Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum. Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).
- Stutzenberger, F. J. Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost. Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).
