Summary
이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.
Abstract
셀룰로스, 지구상의 유기 탄소의 가장 풍부한 원천은, 생물 연료 생산 1 증가 중심으로 광범위한 산업 애플 리케이션을했다. 셀룰로스를 수정하거나 저하에 화학 방법은 일반적으로 강한 지방산과 높은 온도를 필요로합니다. 따라서, 효소 방법은 bioconversion 과정에서 두드러진되고 있습니다. 박테리아와 곰팡이 격리에서 Active cellulases의 식별은 다소 효과가있다지만, 자연 미생물의 대부분은 실험 재배에 저항. 또한 metagenomic, 심사 방식으로 알려진 환경 게놈은 소설 bioconversion 효소에 대한 검색 재배 격차를 브리징 큰 약속을했습니다. 토양 2, 버팔로 제일위 3 콩고 레드 염료 (테더와 우드 5 방법에 따라) 물들일 흰개미 뒷다리 - 직감 4 사용 carboxymethylcellulose (CMC) 한천 플레이트와 같은 다양한으로 Metagenomic 심사 방식이 성공적으로 환경에서 소설 cellulases를 발견했습니다. 그러나, CMC 메서드가 처리량 제한됩니다, 양적되지 않고 잡음 비율 6 낮은 신호를 승객 명단. 다른 방법은 7,8를보고 있지만 각 사용 대형 삽입 게놈 라이브러리의 높은 처리량 검사 바람직하지는 한천 플레이트 기반의 분석.했습니다 여기서 우리는 솔루션을 기반 chromogenic dinitrophenol (DNP) cellobioside 기판 9를 사용 cellulase 활동에 대한 화면을 제시한다. 우리 도서관은 복사 번호 유도 열을 통해 분석 감도를 높이기 위해 fosmid pCC1 복사 제어에 복제되었습니다. 방법은 흡광도 측정으로 제공되는 최종 판독과 함께 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다. 이 저장되어 첨부 스태킹 시스템으로 액체 처리기 및 플레이트 판독기를 사용하여 하루에 100X 384 잘 접시 최대의 처리량과 양적 민감하고 자동으로 진행됩니다.
Protocol
이 프로토콜을 시작하기 전에, 당신은 384 잘 플레이트 형식으로 저장하여 metagenomic 라이브러리가 필요합니다. 우리의 연구에서는, 우리는 파지 T1 방지 TransforMax EPI300 - T1 R E.와 함께 pCC1 복사 제어 fosmid 벡터를 사용 도서관 호스트 및 -80 ° C 11 시에 우리 접시 저장된 대장균 세포.
1. Metagenomic 도서관 플레이트의 복제
- 37 라이브러리를 포함하는 서리를 없애다 플레이트는 ° C 약 20 분 동안, 또는 때까지 우물을 해동합니다.
- 15 분 동안 로봇을 소독하기 위해 qPix2에 자외선 살균 기능을 사용합니다.
- 500mL 시약 병에 100ug/mL에서 12.5ug/mL와 arabinose의 최종 농도에서 chloramphenicol와 LB의 국물을 준비합니다. 각각의 플레이트는 약 20mL를 사용, 플러스 죽은 볼륨 수 있도록 추가 50mL을 다할 것입니다.
- 미디어 병은 멸균 튜브를 통해 매니폴드에 부착된와 당 제조 업체의 지침으로 qFill3를 설정합니다. 미디어의 적절한 금액을 위해 프로그램, 각 우물에 45uL 볼륨을 채우기 위해 그것을 설정합니다.
- 미디어 다기관 각 핀에서 오는 볼 때까지 로봇의 퍼지 기능을 사용하여 튜브와 매니폴드의 공기를 정화.
- qFill3를 사용하여 LB 미디어와 함께 접시에 원하는 번호를 입력합니다. 각 플레이트 채워 약 20 초 정도 걸립니다.
- qPix2 로봇의 해당 영역으로 도서관 접시와 신선한 접시를로드합니다. 후면 욕조에서 2% Micro90, 중앙 목욕탕에 증류수를 autoclaved, 전면 욕조에서 80 % 에탄올, 적절한 시약으로 청소 목욕탕을 입력합니다.
- qPix2의 "복제"프로그램을 사용합니다. 소프트웨어, 소스 접시와 목적지 플레이트의 적절한 머리 숫자와 유형을 선택합니다. 또한 각 욕탕에 일반적으로 복제, 6주기 사이의 청소 머리를 설정하는 것만으로 충분합니다. 기계의 용량은 한 번에 10 접시이며, 그것은 384 핀 헤드 (또는 96 핀 머리로 약 50 분)와 함께 그들 모두를 복제하기 위해 약 15 분 정도 소요됩니다.
참고 : "대상을 흔들어" "소스를 저어"또는 수있는 옵션이 있습니다. 그것은 문제가 이전에 우리의 로봇을 이용하여 발생한 이러한 옵션을 사용하지 않는 것이 좋습니다. - 접시가 복제되면, 습도 상자에 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 성장. 우리가 arabinose를 추가로 fosmid 높은 사본 번호를 유도하기 때문에, 클론이 아닌 유발 클론보다 느리게 성장하는 경향이있다. -80 ° C.에 라이브러리 접시를 반환
참고 : 습도 상자에서 부화 미디어의 증발이 모든 우물을위한 균일한 환경을 유지, 접시의 가장자리에있는 우물에서 발생하지 않습니다 보장합니다. - 첫째 물 (~ 50mL) 후 80 % 에탄올 (~ 50mL)로 정화하여 qFill3 로봇을 청소하십시오. 구성 요소를 분해하고, 알루미늄 호일에 싸서 병, 뚜껑, 그리고 튜브를 청소하고 압력솥.
2. E.의 성장을 측정 콜리 클론
- 37 ° C 배양기에서 접시를 제거합니다. 제거하고 최대 25 접시의 최대, RapidStak와 함께 제공되는 잡지 로딩 플랫폼에 뚜껑, 장소 플레이트를 별도로 설정할 수 있습니다.
참고 : 스택의 맨 아래에있는 접시를 읽을 수있는 첫 번째 것입니다. 소프트웨어가이 기록하지 않는 한, 접시의 순서를 추적해야합니다. - 신속한 Stak 한 잡지를 제거 그것이 비어 있도록하고, 읽을 수 접시의 스택에 밀어. 핸들에 의해 그것을 잡아, 접시는 모두 잡지에로드해야합니다. RapidStak에 잡지를로드합니다.
참고 : 잡지는 접시의 A1 우물 가야하는 코너 나타내는 모서리에있는 작은 나사를하고 있습니다. 이 잡지는 한 방향 RapidStak에 마운트됩니다. - 기계에 연결된 컴퓨터에있는 SkanIt의 RE 프로그램을 엽니다. "새 세션"을 선택하고 적절하게 그것을 이름을 지정합니다. 플레이트 형식으로 "코닝 플랫 바텀 384 잘 플레이트"를 선택합니다.
- "플레이트 레이아웃"영역에서 "마법사"버튼을 선택하고, 접시에 384 지문을 추가로 선택합니다.
- "프로토콜"영역에서 "음 루프"옵션을 선택하고, 384 우물에 대한 입력합니다. "글쎄 루프"아이콘이 화면의 왼쪽에있는 흐름 - 트리에 나타납니다. 아이콘을 선택하고 "광도계의 측정"를 추가합니다. 600nm에서 읽을 수를 설정합니다.
- 고유한 이름으로 프로토콜을 저장하고 SkanIt RE 프로그램을 닫습니다.
- 컴퓨터에서 PolaraRS 프로그램을 엽니다.
- 메인 페이지에 RapidStak 장치에 연결된 악기를 목록 테이블이있을 것입니다. VarioSkan이 테이블의 왼쪽에 있어야합니다. VarioSkan 제목 아래 두 개의 링크가있을 것입니다, "RunSession"및 "부화". "RunSession"옵션을 클릭합니다.
- 새 창에서, 분석 창, 중간에 순서로 나타납니다. "RunSession"항목을 (이것은 유일한 항목 존재한다)를 선택합니다. 화면의 우측 드롭 다운 메뉴에서나타납니다. 이 메뉴에서 실행 저장된 SkanIt의 RE의 이름을 찾으십시오.
참고 :이 메뉴에는 합리적인 순서는 없어 보입니다. 그것은 알파벳 아니라, 또는 날짜에 의해 추가, 또는 컴퓨터의 프로토콜이 저장된 위치를 관련. 이것은 고통이다 자신을 찾는하기 전에 모든 프로토콜을 통해 보여야. - 일단 오른쪽 상단 모서리에있는 당신의 프로토콜을 선택 "이 분석을 실행"을 클릭하십시오.
- 상자의 소스로 사용할 수있는 잡지를 나타내는 당신을 묻는 팝업 것이며, 어떤 잡지가 비어 있습니다. 화면의 하단 상자는 전면 잡지에 해당합니다. [옵션 : 그것이 걸릴 것이다 시간의 금액에 대한 견적을 결정하기 위해 로드된 접시의 숫자를 입력 해주기를 부탁합니다. 이 예측은 일반적으로 기울어져 있습니다.]
- RapidStak과 VarioSkan 모두 켜져 있는지 확인하고, "OK"를 누릅니다.
- RapidStak 자동으로 접시의 지속적인 측정을 위해 수 있도록 플레이트 판독기에 번호판을로드합니다. 25 접시를 읽으려면 대략 50 분 걸립니다.
참고 :이 기계의 적절한 정렬을 보장하기 위해 VarioSkan에 첫 번째 판 로딩을 관찰하는 것이 좋습니다. RapidStak이 플레이트 리더를 제대로로드되지 않는 경우 PolaraRS 윈도우의 오른쪽 상단 모서리에있는 "일시 중지이 분석"버튼을 사용합니다. - VarioSkan 모든 접시를 읽는 완료되면 전체 잡지를 제거하고 잡지 로딩 플랫폼에 놓으십시오. 플랫폼의 바깥쪽 사각형을 올려, 그리고 잡지 중간에 더미 서 번호판을 떠나, 밀어해야합니다. 해당 접시에 뚜껑을 교체하십시오.
3. 각 플레이트에 분석 믹스 추가
- 산도 5.5에서 50mM 칼륨 아세테이트 버퍼에 용해 혼합의 premade 10X 주식 (10 % 트리톤 X - 100, 100mM RIS, 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))를 사용하여 분석 믹스를 준비합니다. 기판이 완전히 해소되어 있는지 확인하고, DMSO에 75mg/mL DNP - cellobioside 기판 최대의 재고를 준비합니다. 검정 믹스에 0.1mg/mL의 최종 농도 DNP - cellobioside 주식 솔루션을 추가합니다. 각 판은 솔루션의 약 20mL를 사용하여, 플러스 죽은 볼륨 수 있도록 추가 50mL을 다할 것입니다.
참고 : DNP - Cellobioside은 용해도가 증가하므로 DMSO에 용해, 물에 쉽게 용해되지 않습니다. 최종 분석 솔루션에서 DMSO의 존재는 눈에 띄는 효과가 없습니다. - 미디어 병은 멸균 튜브를 통해 매니폴드에 부착된와 당 제조 업체의 지침으로 qFill3를 설정합니다. 미디어의 적절한 금액을 위해 프로그램, 각 우물에 45uL 볼륨을 채우기 위해 그것을 설정합니다.
- 미디어 다기관 각 핀에서 오는 볼 때까지 로봇의 퍼지 기능을 사용하여 튜브와 매니폴드의 공기를 정화.
- qFill3를 사용하여 각 플레이트에 분석 믹스를 추가합니다. 각 플레이트 채워 약 20 초 정도 걸립니다.
- 검정 혼합이 추가되면 37 번호판을 품어 ° C를 습도 상자에 12-16시간하십시오.
참고 : 분석 믹스 한 접시 이상의 - 부화가 추가하면 내부 우물을 보지보다 높은 흡광도 수치를 항복, 접시의 바깥쪽 우물의 증발을 일으킬 것입니다. 이것은 습도 챔버에서 번호판을 잠복기로 상쇄 수 있습니다.
4. Assayed 클론 읽기 흡광도
- 37 ° C 배양기에서 접시를 제거합니다. 제거하고 최대 25 접시의 최대, RapidStak와 함께 제공되는 잡지 로딩 플랫폼에 뚜껑, 장소 플레이트를 별도로 설정할 수 있습니다.
참고 : 스택의 맨 아래에있는 접시를 읽을 수있는 첫 번째 것입니다. 소프트웨어가이 기록하지 않는 한, 접시의 순서를 추적해야합니다. - 신속한 Stak 한 잡지를 제거 그것이 비어 있도록하고, 읽을 수 접시의 스택에 밀어. 핸들에 의해 그것을 잡아, 접시는 모두 잡지에로드해야합니다. RapidStak에 잡지를로드합니다.
참고 : 잡지는 접시의 A1 우물 가야하는 코너 나타내는 모서리에있는 작은 나사를하고 있습니다. 이 잡지는 한 방향 RapidStak에 마운트됩니다. - 기계에 연결된 컴퓨터에있는 SkanIt의 RE 프로그램을 엽니다. "새 세션"을 선택하고 적절하게 그것을 이름을 지정합니다. 플레이트 형식으로 "코닝 플랫 바텀 384 잘 플레이트"를 선택합니다.
- "플레이트 레이아웃"영역에서 "마법사"버튼을 선택하고, 접시에 384 지문을 추가로 선택합니다.
- "프로토콜"영역에서 "음 루프"옵션을 선택하고, 384 우물에 대한 입력합니다. "글쎄 루프"아이콘이 화면의 왼쪽에있는 흐름 - 트리에 나타납니다. 아이콘을 선택하고 "광도계의 측정"를 추가합니다. 400nm에서 읽을 수를 설정합니다.
- 고유한 이름으로 프로토콜을 저장하고 SkanIt RE 프로그램을 닫습니다.
- 컴퓨터에서 PolaraRS 프로그램을 엽니다.
- 메인 페이지에 RapidStak 장치에 연결된 악기를 목록 테이블이있을 것입니다. VarioSkan이 테이블의 왼쪽에 있어야합니다. VarioSkan 제목 아래 두 개의 링크가있을 것입니다, "RunSession"와 "IncubatE ". 클릭하여"RunSession "옵션을.
- 새 창에서, 분석 창, 중간에 순서로 나타납니다. "RunSession"항목을 (이것은 유일한 항목 존재한다)를 선택합니다. 화면의 오른쪽에있는 드롭 다운 메뉴가 나타납니다. 이 메뉴에서 실행 저장된 SkanIt의 RE의 이름을 찾으십시오.
- 일단 오른쪽 상단 모서리에있는 당신의 프로토콜을 선택 "이 분석을 실행"을 클릭하십시오.
- 상자의 소스로 사용할 수있는 잡지를 나타내는 당신을 묻는 팝업 것이며, 어떤 잡지가 비어 있습니다. 화면의 하단 상자는 전면 잡지에 해당합니다. [옵션 : 그것이 걸릴 것이다 시간의 금액에 대한 견적을 결정하기 위해 로드된 접시의 숫자를 입력 해주기를 부탁합니다. 이 예측은 일반적으로 기울어져 있습니다.]
- RapidStak과 VarioSkan 모두 켜져 있는지 확인하고, "OK"를 누르십시오
- RapidStak 자동으로 접시의 지속적인 측정을 위해 수 있도록 플레이트 판독기에 번호판을로드합니다.
참고 :이 기계의 적절한 정렬을 보장하기 위해 VarioSkan에 첫 번째 판 로딩을 관찰하는 것이 좋습니다. RapidStak이 플레이트 리더를 제대로로드되지 않는 경우 PolaraRS 윈도우의 오른쪽 상단 모서리에있는 "일시 중지이 분석"버튼을 사용합니다. - VarioSkan 모든 접시를 읽는 완료되면 전체 잡지를 제거하고 잡지 로딩 플랫폼에 놓으십시오. 플랫폼의 바깥쪽 사각형을 올려, 그리고 잡지 중간에 더미 서 번호판을 떠나, 밀어해야합니다. 접시는 실험실 절차에 따라 폐기하실 수 있습니다.
- 흡광도 수치를 열고 SkanIt의 RE 소프트웨어를 수출하고 "기존 파일을 엽니다"를 선택합니다.
- 귀하의 세션을 저장한 디렉토리를 선택, 목록을 확장하고 제목 제목 아래 접시의 숫자에 따라 "컨테이너 N"를 "컨테이너 1"표시 옵션가 될 "+"아이콘을 누르십시오. 분석을 가장 먼저 접시를 선택합니다.
- 페이지 상단의 메뉴 표시줄에서 "데이터 처리> 보고서 / 내보내기"를 선택
- 수출 원하는 옵션을 선택합니다.
참고 : 나는 일반적으로 "플레이트 레이아웃"을 선택하고 수출에 대해 "광도계의 '데이터입니다. - '리포트보기'그리고 '파일> 저장'을 클릭합니다. 원하는 디렉토리를 선택합니다. 출력 형식은 Microsoft Excel 스프레드 시트입니다
5. 대표 결과
긍정적인 복제를 포함하는 하나의 384 잘 접시에서 흡광도 수치의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 긍정적인 클론 cellulase 활동을 표현되지 않은 이상 흡광도에 표시된 증가 보여줍니다. 분석 시간의 차이, 접시에 잘 위치, 또는 DNP의 농도는 (해제 해산 DNP을 필터링하여 도입있을 수 있습니다) 절대 흡광도 수치에 영향을 줄 수 있습니다. 같은 플레이트 평균 또는 평균 이상 열 흡광도의 차이로 상대 흡광도 수치가, cellulase 긍정적인 클론을 식별하는보다 강력한 방법입니다.
도서관 접시에서 긍정적인 클론의 확인에 따라, 그것은 차 검사에 대한 새 접시에 모두 긍정적인 클론을 복제하는 것이 좋습니다. 이것은 잘 위치 또는 판 변형으로 인한 효과를 제거하고 긍정적인 클론 사이에 더 직접적인 비교를위한 수 있습니다.
그림 1. metagenomic 도서관에 대한 높은 처리량 분석의 플로우 차트는 E.으로 복제 대장균과 -80에 저장된 ° C.
그림 2. 흡광도 수치가 긍정적인 복제를 포함 한 384 잘 접시에서. Cellulase 긍정적인 클론은 부정적인 클론 이상 크게 증가 흡광도에서 확인할 수 있습니다.
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Discussion
대형 삽입 게놈의 DNA의 metagenomic 라이브러리에서 cellulolytic 활동의 신속한 검출을위한 높은 처리량 화면 E.으로 표현 대장균이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 이 방법은 일반적으로 문학에 사용되는 CMC / 콩고 레드 분석을 통해 개선이다. 이 솔루션을 기반으로하고, 정량 분석을 위해 허용하는 플레이트 판독기에서 흡광도 수치로 최종 출력으로 384 잘 접시에 한 냄비 화학 검사 수 있습니다. 이 프로세스의 각 단계의 자동화는 시간당 25 개 이상 384 잘 접시의 혼자 가잖아 검사 수 있습니다. 데이터는 쉽게 타사 소프트웨어에 의해 분석 또는 처리를위한 수 있도록 Microsoft Excel 스프레드 시트로 소프트웨어에서 내보낼 수 있습니다.
이 분석 중 하나 제한 E.에서 외인성 단백질의 표현 가능성 존재 대장균 호스트. metagenomic 라이브러리는 여러 생물의 DNA를 포함, 하위 집합만있는 E.으로 인식된다 대장균 전사 / 번역 기계. 표현 경우에도, 외인성 유전자 제품은 부적 절한 접는, 처리, 또는 부적 절한 표현 수준에 따라 기능을 달성하지 못할 수도 있습니다. 이전 기능 metagenomic 심사 연구에서 볼 때 이러한 제한은 부분적으로, 복사 제어 시스템의 활용을 통해 상쇄 수 있습니다. 12. pCC1 복사 컨트롤은 셀 13 100 사본을 최대 한에서 유도 L - arabinose의 추가를 통해 유도를 허용하고, 증가 복사 번호 여기에 사용 fosmid. 이러한 시스템은 증가 활동 이후의 유도와 안정성에 대한 단일 복사본 성장을 사용하여 활동 기반 화면의 결과를 향상시킬 수 있습니다.
기판 2,4 - DNP - Cellobioside의 화면에 사용은 공급 업체에서 상용 아니라, 유사한 기판을 구입하실 수 있습니다. 시그마 - 알드리치 2 - nitrophenyl (CAT 번호 N4764)와 4 - nitrophenyl (CAT 번호 N5759) cellobiosides을 제공합니다. 설명한대로 일반적으로 화면이 기판과 함께 수행 될 수 있지만, 일부 수정이 필요할 것입니다. 이러한 모노 - 치환 페놀은 4 근처에 DNP에 비해 7.2 주위 높은 pKa 값을있다. cellulase 활동 최적 산도는 pH를 4.5-6.0 14, 15에서 범위로보고되었습니다. DNP - C의 사용은 cellulases의 쉽게 식별 수 있도록 최적의 산도 조건에서 실시하는 검정을 허용합니다. 또한, 디 - 치환 glycoside 더 꺼려 cellulases의 검출에 대한있게 훨씬 더 반응 다른보다. 따라서, DNP - cellobioside의 사용은 상용 기판 사용할 것입보다 더 견고하고 민감한 화면에 사용할 수 있습니다.
이런 화면이 관련 colorimetric 또는 fluorometric 기판과 함께하는 효소의 검출에 사용될 수있는 주목할 것입니다. Cellulases은 심사 매개 변수의 초기 개발 및 최적화에 이상적인 안정과 활성 효소입니다. 여기에 제시 일반적인 접근 방식은 학술 및 산업용 애플 리케이션을위한 두 metagenomic 라이브러리의 심사를위한 강력한 도구입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 DNP - Cellobioside 기판을 제공하는 스티브 위더스 및 홍콩 - 밍 첸 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | |
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | |
| Varioskan | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| RapidStak | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Connected to Varioskan | |
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 100mg/mL in water |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | In TE buffer solution, 100mM |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | In TE buffer solution, 10mM |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 |
References
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