Summary
Bu protokol, Escherichia coli olarak ifade metagenomic kütüphane selülolitik faaliyetleri için yüksek kapasiteli ekran açıklanmıştır. Ekran, çözüm odaklı ve yüksek otomasyonlu ve absorbans ölçümü gibi son okuma ile 384 iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır.
Abstract
Selüloz, gezegen üzerinde organik karbon en bol kaynak, biyoyakıt üretimi 1 artan bir vurgu ile geniş çaplı endüstriyel uygulamalar vardır. Selüloz değiştirmek veya aşağılamak için kimyasal yöntemler genellikle güçlü asitler ve yüksek sıcaklıklar gerektirir. Bu nedenle, enzimatik yöntemlerle biyolojik dönüşümünün sürecinde önemli hale gelmiştir. Bakteriyel ve fungal izolatlar aktif sellülazlar belirlenmesi biraz etkili olsa da, doğada mikropların büyük çoğunluğunun laboratuar ekimi karşı. Çevre genomik, metagenomic, tarama yaklaşımlar olarak da bilinen yeni biyolojik dönüşümünün enzimleri için arama ekimi boşluğu dolduruyor büyük umutlar var. Metagenomic tarama yaklaşımları başarıyla topraklar 2, manda rumen 3 ve termit, Kongo kırmızı boya (tiyatrosunun ve Ahşap 5 yöntemi dayalı) ile boyanmış, arka-gut 4 kullanarak karboksimetilselüloz (CMC) agar plakları gibi çeşitli ortamlardan roman sellülazlar iyileşti . Ancak, CMC yöntemi hacmi sınırlı, kantitatif değildir ve düşük sinyal gürültü oranı 6 tezahür. Diğer yöntemler 7,8 bildirilen, ancak her kullanımdan büyük ekleme genomik kütüphaneler yüksek verimli tarama için istenmeyen bir agar plaka bazlı analiz,. Burada selüloz aktivite için bir kromojenik dinitrofenol (DNP) cellobioside substrat 9 kullanarak bir çözüm tabanlı ekran mevcut. Bizim kütüphane ile 10 kopya sayısı indüksiyon testinin duyarlılığı artırmak için fosmid pCC1 fotokopi denetim içine klonlandı. Bu yöntem, son okuma absorbans ölçümü olarak sağlanan 384-iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır. Bu okuma kadar bir verim ile bağlı istifleme sistemi ile bir sıvı işleyici ve plaka okuyucu kullanarak günde 100X 384-iyi plakaları, kantitatif, hassas ve otomatik.
Protocol
Bu protokol başlamadan önce, 384 plaka formatında saklanan metagenomic kütüphane gerekecektir. Bizim çalışmamızda, faj T1 dayanıklı TransforMax EPI300-T1 R E. ile birlikte pCC1 kopyasını fosmid vektör kontrolü kütüphane host ve -80 ° C 11 plakalar saklanır gibi coli hücrelerinde.
1. Metagenomic Kütüphane Tabaklar çoğaltılması
- Defrost 37 adresinde kütüphane içeren plakalar ° C'de yaklaşık 20 dakika kadar veya tüm kuyuları çözülmüş.
- QPix2 UV ışık sterilizasyon özelliği, 15 dakika süreyle robot sterilize etmek için kullanın.
- 500ml reaktif şişesi 100ug/mL 12.5ug/mL ve arabinoz final konsantrasyonda kloramfenikol ile LB suyu hazırlayın. Her plaka yaklaşık 20ml, artı ölü hacim izin vermek için ek bir 50ml yapmak.
- QFill3 medya şişe steril tüp yoluyla manifolduna bağlı başına üreticinin talimatlarına olarak ayarlayın. Için uygun ortam miktarı Programı, her kuyuda bir 45uL hacmi doldurmak için ayarlayın.
- Medya manifoldu her pin gelen görünür kadar robot tasfiye özelliğini kullanarak tüp ve manifolddan hava temizleyin.
- QFill3 kullanarak LB medya ile istenilen sayıda plaka doldurun. Her plaka doldurmak için yaklaşık 20 saniye sürer.
- QPix2 robot uygun alanlara kütüphane plakaları ve taze plakaları yükleyin. % 2 Micro90 arka hamamı, orta banyosunda distile su otoklava,% 80 etanol ön banyo; uygun reaktifler ile temizleme banyoları doldurun.
- QPix2 "Klonlanması" programını kullanın. Yazılım, kaynak plakaları ve hedef plakaları uygun kafa, sayı ve türlerini seçin. Ayrıca, her banyo, tekrarlamalı, genelde 6 kür arasında temiz başkanı ayarlamak yeterli olacaktır. Makine Kapasitesi, bir seferde 10 plaklık ve 384 iğne başı (ya da 96 iğne başı ile yaklaşık 50 dakika) ile tüm bunları çoğaltmak için yaklaşık 15 dakika sürer.
Not: "Hedef karıştırın" "Kaynak karıştırın" ya da bir seçenek yoktur. Bu sorunları bizim robot onları kullanarak önceden meydana gelmiş gibi bu seçenekleri kullanmak için tavsiye edilir. - Plakalar çoğaltılır sonra 37 ° C'de 24 saat boyunca nem kutusu plakalar büyüyecek. Arabinoz ilavesi ile yüksek bir kopya sayısı fosmid inducing olduğundan, klonlar dışı kaynaklı klonlar daha yavaş büyürler. -80 ° C'ye kadar kütüphane plakaları
Not: nem kutusu Kuluçka medya buharlaşma tüm kuyuları için tek tip bir ortamda tutulması, plakaların kenarında kuyularda oluşmaz sağlar. - QFill3 robot ilk su (~ 50 ml) ve% 80 etanol (~ 50 ml) ile tasfiye ederek temizleyin. Bileşenleri sökün ve alüminyum folyo sarılı şişe, kapak ve tüp temiz ve otoklav.
2. E. Büyüme Ölçme coli Klonlar
- 37 ° C inkübatör plakaları çıkarın. Çıkarın ve maksimum 25 plakaların, RapidStak ile sağlanan dergisi yükleme platformu üzerine, kapaklar, ve yer plakaları bir kenara koyun.
Not: yığının altındaki plaka okunacak ilk olacak. Plakalar sırasını takip yazılımı bu yazmaz olarak emin olun. - Rapid Stak bir dergi çıkarın, boş olduğundan emin olun ve plakaları okunacak yığınının üzerine itin. Kolundan tut ve plakalar dergi içine yüklenmiş olması gerekir. RapidStak dergisi yükleyin.
Not: Derginin plakaların A1 kuyu gitmeli hangi köşede gösteren köşesinde küçük bir vida vardır. Dergi, sadece tek bir yönde RapidStak monte edecek. - Makinelere bağlı olan bilgisayarda SkanIt RE programını açın. "Yeni Oturum" seçin ve uygun şekilde isim. Plaka tipi olarak "Corning Daire Alt 384-plaka" seçin.
- "Plaka Düzen" alanında, "Sihirbaz" butonunu seçin ve plaka 384 bilinmeyenli eklemek için seçin.
- "Protokol" alanında, "Well Loop" seçeneğini seçin ve 384 kuyu için girin. "Well Loop" simgesi ekranın sol tarafındaki akış ağacında görünür. Simgesini seçin ve "Fotometrik Ölçüm" eklemek için tıklayın. 600Nm az okumak için ayarlayın.
- Protokol benzersiz bir ad ile kaydedin ve SkanIt RE programı kapatın.
- Bilgisayarda, PolaraRS programı açın.
- Ana sayfada RapidStak cihaza bağlı araçların listelendiği tablo olacaktır. VarioSkan Bu tablonun sol tarafında olmalıdır. VarioSkan başlığı altında, iki bağlantılar olacak "RunSession" ve "inkübe". "RunSession" seçeneğini tıklayın.
- Ortada bir akış şeması ile yeni bir pencere, tahlil penceresi görünecektir. "RunSession" kalemi (tek öğe mevcut olmalıdır) seçin. Ekranın sağ tarafında açılan menüdengörünecektir. Bu menüyü çalıştırmak kaydedilen SkanIt RE adını bulun.
Not: Bu menüde hiçbir rasyonel sipariş var. Alfabetik veya tarihe göre eklenebilir veya bilgisayarda protokol nerede kaydedilmiş olduğu ile ilgili. Bu bir ağrı kendi bulmadan tüm protokolleri üzerinden bakmak gerekir demektir. - Bir kez sağ üst köşesinde, protokolü seçili "Bu testte Çalıştır" a tıklayın.
- , Kaynak olarak kullanmak için hangi dergisi göstermek için isteyen bir kutu açılır, ve hangi dergisi boştur. Ekranda alt kutusu ön dergisi için karşılık gelir. [Opsiyonel: Bu zaman alacak miktarı için bir tahmin belirlemek için yüklü plakaların sayısı girmenizi ister. Bu tahmin normal yolu kapalıdır.]
- RapidStak ve VarioSkan açık olduğundan emin olun ve "OK" tuşuna basın.
- RapidStak plakaların sürekli ölçümler için izin veren otomatik plaka okuyucu sizin plakaları yükleyecektir. 25 plakalar okumak için yaklaşık 50 dakika sürer.
Not: Bu makinelerin uygun uyum sağlamak için VarioSkan ilk plaka yükleme gözlemlemek için tavsiye edilir. RapidStak plaka okuyucu düzgün yüklenmiyorsa, PolaraRS pencerenin sağ üst köşesindeki "Duraklat Bu testte" butonunu kullanın. - VarioSkan tüm plakalar okuma yapıldıktan sonra, tam bir dergi çıkarmak ve dergi yükleme platformu üzerine yerleştirin. Platformun dış dikdörtgen yukarı kaldırın ve dergi ortasında bir yığın halinde duran tabak bırakarak, kapalı slayt gerekir. Uygun tabak kapakları değiştirin.
3. Her Plate Test Mix eklenmesi
- 50mm potasyum asetat tamponu pH 5.5 lizis karışımı premade 10x stok (10% Triton X-100, 100 mM ris, 10mM EDTA) kullanarak tahlil karışımı hazırlayın. Yüzey tamamen çözülmüş olduğundan emin DMSO 75mg/mL DNP cellobioside substrat kadar bir stok hazırlayın. Oynamadı-cellobioside stok solüsyonu 0.1mg/mL bir final konsantrasyon tahlil karışımı ekleyin. Her plaka çözüm yaklaşık 20ml, artı ölü hacim izin vermek için ek bir 50ml yapmak.
Not: DNP Cellobioside çözünürlük artar DMSO içinde eriterek, suda kolayca çözünür değildir. Son tahlil çözüm DMSO varlığı hiçbir gözlemlenebilir etkileri vardır. - QFill3 medya şişe steril tüp yoluyla manifolduna bağlı başına üreticinin talimatlarına olarak ayarlayın. Için uygun ortam miktarı Programı, her kuyuda bir 45uL hacmi doldurmak için ayarlayın.
- Medya manifoldu her pin gelen görünür kadar robot tasfiye özelliğini kullanarak tüp ve manifolddan hava temizleyin.
- QFill3 kullanarak her plaka tahlil karıştırın. Her plaka doldurmak için yaklaşık 20 saniye sürer.
- Tahlil karışımı eklenir sonra, 37 plakalar inkübe ° C nem kutusu 12-16 saat.
Not: tahlil karışımı bir kez plakalar üzerinde-inkübasyon eklenir plaka dış kuyu içinde kuyu daha yüksek absorbans okuma alındı buharlaşma neden olacaktır. Bu bir nem odası plakalarının kuluçka tarafından telafi edilebilir.
4. Analiz Edilmiş Klonlar Okuma Absorbans
- 37 ° C inkübatör plakaları çıkarın. Çıkarın ve maksimum 25 plakaların, RapidStak ile sağlanan dergisi yükleme platformu üzerine, kapaklar, ve yer plakaları bir kenara koyun.
Not: yığının altındaki plaka okunacak ilk olacak. Plakalar sırasını takip yazılımı bu yazmaz olarak emin olun. - Rapid Stak bir dergi çıkarın, boş olduğundan emin olun ve plakaları okunacak yığınının üzerine itin. Kolundan tut ve plakalar dergi içine yüklenmiş olması gerekir. RapidStak dergisi yükleyin.
Not: Derginin plakaların A1 kuyu gitmeli hangi köşede gösteren köşesinde küçük bir vida vardır. Dergi, sadece tek bir yönde RapidStak monte edecek. - Makinelere bağlı olan bilgisayarda SkanIt RE programını açın. "Yeni Oturum" seçin ve uygun şekilde isim. Plaka tipi olarak "Corning Daire Alt 384-plaka" seçin.
- "Plaka Düzen" alanında, "Sihirbaz" butonunu seçin ve plaka 384 bilinmeyenli eklemek için seçin.
- "Protokol" alanında, "Well Loop" seçeneğini seçin ve 384 kuyu için girin. "Well Loop" simgesi ekranın sol tarafındaki akış ağacında görünür. Simgesini seçin ve "Fotometrik Ölçüm" eklemek için tıklayın. 400nm az okumak için ayarlayın.
- Protokol benzersiz bir ad ile kaydedin ve SkanIt RE programı kapatın.
- Bilgisayarda, PolaraRS programı açın.
- Ana sayfada RapidStak cihaza bağlı araçların listelendiği tablo olacaktır. VarioSkan Bu tablonun sol tarafında olmalıdır. VarioSkan başlığı altında, iki bağlantılar olacak "RunSession" ve "Incubate "." RunSession "seçeneğini tıklayın.
- Ortada bir akış şeması ile yeni bir pencere, tahlil penceresi görünecektir. "RunSession" kalemi (tek öğe mevcut olmalıdır) seçin. Ekranın sağ tarafında bir açılır menü belirecektir. Bu menüyü çalıştırmak kaydedilen SkanIt RE adını bulun.
- Bir kez sağ üst köşesinde, protokolü seçili "Bu testte Çalıştır" a tıklayın.
- , Kaynak olarak kullanmak için hangi dergisi göstermek için isteyen bir kutu açılır, ve hangi dergisi boştur. Ekranda alt kutusu ön dergisi için karşılık gelir. [Opsiyonel: Bu zaman alacak miktarı için bir tahmin belirlemek için yüklü plakaların sayısı girmenizi ister. Bu tahmin normal yolu kapalıdır.]
- RapidStak ve VarioSkan açık olduğundan emin olun ve "OK" tuşuna basın
- RapidStak plakaların sürekli ölçümler için izin veren otomatik plaka okuyucu sizin plakaları yükleyecektir.
Not: Bu makinelerin uygun uyum sağlamak için VarioSkan ilk plaka yükleme gözlemlemek için tavsiye edilir. RapidStak plaka okuyucu düzgün yüklenmiyorsa, PolaraRS pencerenin sağ üst köşesindeki "Duraklat Bu testte" butonunu kullanın. - VarioSkan tüm plakalar okuma yapıldıktan sonra, tam bir dergi çıkarmak ve dergi yükleme platformu üzerine yerleştirin. Platformun dış dikdörtgen yukarı kaldırın ve dergi ortasında bir yığın halinde duran tabak bırakarak, kapalı slayt gerekir. Plakaları laboratuvar prosedürlerine uygun olarak imha edilebilir.
- Absorbans okumaları, açık SkanIt RE yazılımı, ihracat ve "varolan bir dosya Aç" seçeneğini seçin.
- Listeyi genişletmek için oturumu kaydettiğiniz dizini seçin ve plaka sayısına bağlı olarak "Konteyner N", "Konteyner 1" etiketli seçenekleri başlığı adı altında olacak "+" simgesine vurdu. Analiz edilecek ilk plaka seçin.
- Sayfanın üst kısmındaki menü çubuğunda, "Veri İşleme> Rapor / Export" seçeneğini seçin
- Ihracat için istediğiniz seçenekleri seçin.
Not: Ben genellikle "Plaka Düzen" seçin ve "ihracat için Fotometrik" veri. - "Görünüm Raporu" ve sonra "Dosya> Kaydet" tıklayınız. İstenilen dizin seçin. Çıkış biçimi, bir Microsoft Excel elektronik tablosu
5. Temsilcisi Sonuçlar
Olumlu bir klon içeren tek bir 384 plaka absorbans okumaları bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. Pozitif klonlar absorbans selülaz aktivitesi ifade edenler üzerinde belirgin bir artış göstermektedir. Tahlil zaman farklılıklar, plaka iyi konum veya DNP konsantrasyonu (un-çözünmüş DNP filtre tarafından tanıtıldı olabilir) mutlak absorbans okumaları etkileyebilir. Selülaz pozitif klonların belirlenmesi plaka ortalama veya sütun ortalaması yukarıda absorbans farkı gibi Bağıl absorbans okumaları, daha sağlam bir yöntem.
Kütüphane plakalar pozitif klonların belirlenmesi ardından, ikincil tarama için yeni bir tabak içine tüm olumlu klonlar çoğaltmak için tavsiye edilir. Bu iyi bir konum ya da plaka değişimi kaynaklanan etkileri ortadan kaldırır ve olumlu klonlar arasında daha doğrudan bir karşılaştırma için izin verir.
Şekil 1 metagenomic bir kitaplık için yüksek verimlilik testinin Akış şeması E. klonlanmış coli ve ° C -80 saklanan .
Şekil 2 adet 384-plaka olumlu bir klon içeren Absorbans okuma. Selülaz pozitif klonların negatif klonları üzerinde önemli ölçüde artmıştır absorbans tarafından tespit edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
E. ifade selülolitik aktivitenin büyük bir ekleme genomik DNA metagenomic kütüphane hızlı tespiti için yüksek kapasiteli ekran Bu protokolde coli açıklanmıştır. Bu yöntem, literatürde sıkça kullanılan CMC / Kongo Red tahlil üzerinde bir gelişmedir. Çözüm odaklı ve kantitatif analiz için izin veren bir plaka okuyucu absorbans okumaları son çıkışı ile, 384-kuyucuğu bir pot kimya tarama sağlar. 25 veya daha fazla saat başına 384-kuyu plakaların denetimsiz bir tarama için bu sürecin her adımında otomasyon sağlar. Üçüncü parti yazılım tarafından analiz ya da işlem için izin verileri kolayca, bir Microsoft Excel yazılımı ihraç edilebilir.
Bu testte bir sınırlama E. eksojen proteinlerin ifade potansiyeli var coli ev sahibi. Metagenomic kütüphane birçok farklı organizmaların DNA içerir, yalnızca bir alt kümesi olan E. tarafından kabul edilebilir coli transkripsiyon / çeviri makine. Ifade bile olduğunda, ekzojen gen ürünleri, uygunsuz katlama, işleme, ya da yetersiz ifade düzeyleri nedeniyle işlevsellik elde değil. Bu sınırlamalar, önceki fonksiyonel metagenomic tarama çalışmalarında görüldüğü gibi kısmen kopyasını kontrol sistemlerinin kullanımı ile telafi edilebilir. 12 . PCC1 kopyasını kontrol 13 hücre başına 100 kopya, bir indükleyicisi L-arabinoz eklenmesi yoluyla indüksiyon sağlar ve kopya sayısını arttırır Burada kullanılan fosmid. Bu sistemler, sonraki aktivite artışı indüksiyon ile istikrar için tek bir kopyasını büyüme sağlayarak, faaliyet tabanlı ekranlar sonucunu artırabilirsiniz.
Yüzey ekran kullanılan 2,4-Oynamadı-Cellobioside tedarikçilerden ticari olarak mevcut değildir, ancak benzer malzemeleri satın alınabilir. Sigma-Aldrich 2-nitrofenil (Cat No N4764) ve 4-nitrofenil (Cat No N5759) cellobiosides sunmaktadır. Açıklandığı gibi bu yüzeylerin genel ekran ile yapılmalıdır, ancak bazı değişiklikler gerekmektedir. Bunlar mono-sübstitüe fenoller 4 civarına DNP göre, 7.2 civarında, yüksek pKa değerleri var. Selülaz aktivitesi için optimum pH, pH 4,5-6,0 14, 15 aralığında rapor edilmiştir . Oynamadı-C kullanımı, optimum pH koşullarında yapılmalıdır tayini için sellülazlar daha kolay tanımlama için izin sağlar. Buna ek olarak, di-sübstitüe glikozid diğerlerine göre çok daha reaktif daha isteksiz sellülazlar tespiti için izin verir. Böylece, Oynamadı-cellobioside kullanımı, ticari ürünler ile kullanılabilir olacağını daha daha sağlam ve hassas bir ekran için izin verdi.
Bu ekran ilişkili bir kolorimetrik veya florometrik substrat ile herhangi bir enzimlerin tespiti için kullanılabilir olması dikkat çekicidir. Sellülazlar kararlı ve aktif bir enzim, tarama parametrelerini ilk geliştirilmesi ve optimizasyonu için ideal bir. Burada sunulan genel yaklaşım, hem de akademik ve endüstriyel uygulamalar için metagenomic kütüphanelerin tarama için güçlü bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Oynamadı-Cellobioside substrat sağlamak için Dr. Steve Withers ve Hong-Ming Chen teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | |
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | |
| Varioskan | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| RapidStak | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Connected to Varioskan | |
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 100mg/mL in water |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | In TE buffer solution, 100mM |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | In TE buffer solution, 10mM |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 |
References
- Rubin, E. M. Genomics of cellulosic biofuels. Nature. 454, 841-845 (2008).
- Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase. J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).
- Duan, C. J. Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens. J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).
- Zhang, Y. H. P. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Sharrock, K. R. Cellulase assay methods: a review. J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).
- Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine. Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).
- Huang, J. S., Tang, J. Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).
- Tull, D., Withers, S. G. Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi. Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).
- Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. PNAS. 104, 5590-5595 (2007).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J Vis Exp. , (2009).
- Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).
- Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).
- Johnson, E. A. Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum. Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).
- Stutzenberger, F. J. Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost. Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).
