Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Использование потоков для слива воды и вращающихся дисков для реакторов Золотистый стафилококк Биопленка Анализ

Published: December 27, 2010 doi: 10.3791/2470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan

ERRATUM NOTICE

Summary

Протоколы для использования открытых биопленки проточной системе с реакторами капельного потока и вращающегося диска реакторов приведены в деталях.

Abstract

Большинство микробов в природе, как считается, существуют в качестве поверхностно-связанной общин в биопленки. 1 Бактериальные биопленки заключены в пределах матрицы и прикреплен к поверхности. 2 образование биопленки и развития, как правило, изучается в лаборатории с помощью пакетных систем, таких как микротитровальных пластин или потока системы, такие как поток-клеток. Эти методики полезны для скрининга мутантов и химических библиотек (микротитровальных пластин) 3 или выращивание биопленки для визуализации (поток клетки) 4. Здесь мы приведем подробные протоколы для выращивания золотистого стафилококка в двух дополнительных типов биопленки поток системы: биопленки капельного потока реактора и вращающийся диск реактора биопленки.

Капельное реакторов поток биопленки предназначены для изучения биопленки, выращенных в условиях низкого сдвига. 5 реактор капельного потока состоит из четырех параллельных каналов теста, каждый из которых способен проведение одного стандартного стекла стекло микроскопа размера купона, или длина катетера или пребывания. Реактор капельного потока идеально подходит для микросенсора мониторинга, общих исследований биопленки, биопленки cryosectioning образцы, высокая производства биомассы, медицинская оценка материала, и пребывающего медицинское тестирование устройства. 6,7,8,9

Вращающегося диска реактора состоит из диска содержащие тефлон углублениями для съемных купонов. 10 съемных купоны могут по какой-либо из обрабатываемых материалов. В нижней части диска, вращающегося содержит магнитный стержень, чтобы вращения диска для создания жидкой поверхности сдвига по поверхности флеш-купонов. Весь диск, содержащий 18 купонам устанавливается в 1000 мл боковые стекла руке реактора. Жидких средах рост циркулирует через сосуд в то время как диск вращается с помощью магнитной мешалки. Купоны будут удалены из корпуса реактора, а затем соскабливают собирать биопленки образец для дальнейшего изучения или микроскопии изображений. Вращающийся диск реакторы предназначены для лабораторной оценки биоцида эффективности, удаление биопленки и производительность противообрастающих материалов. 9,11,12,13

Protocol

1. Биопленка Капельное проточном реакторе

  1. Биопленки капельного потока реактора (в продаже с Biosurface технологии или специально созданных версий обычно могут быть сделаны магазинов университета машины, см. Рисунок 1) собирается и в автоклаве. Ассамблея включает в себя проставление купоны в камерах и обеспечения крышки камеры. Камеры, а также биопленки среды (триптического бульон соевый 2 г / л и глюкозы 2 г / л) и влиятельных питательной трубки стерилизуют в автоклаве.
  2. Прививка от реактора поток капельного предварительно поставив реактора на плоской поверхности, зажимая стоков линий трубки, заполняя каждую камеру с 10 мл соевого триптического бульон и добавить по 10 мкл С. золотистого культуры выращивали в течение ночи в триптического бульон сои. Прививку реактор затем поместите в 37 ° C инкубаторе в течение 18 часов.
  3. После 18 часов инкубации стоков Трубы unclamped и реактор помещают на деревянный брусок, чтобы сократить угол 10 °.
  4. Асептических условиях подключения влиятельных питательной трубки в бутылку, содержащую питательные бульоны непрерывного потока. Поток трубки линии, проходящей через насос и премьер труб путем запуска насоса при максимальной скорости (будет варьироваться в зависимости от модели насоса).
  5. После влиятельных трубы заливают остановка насоса и приложить подключения иглы (22 калибра, 1 дюйм), чтобы в конце каждой трубки. Протрите пробку камеры входе с этанолом вытереть и асептически вставить иглы через входное отверстие пробкой.
  6. Включите насос и дайте СМИ медленно капельно (расход ~ 125 мкл / мин) по сравнению с купонами. СМИ должны течь вниз по купону от входного отверстия пробкой, чтобы сточные воды портов. Эксплуатация реактора в непрерывный поток в течение 2-5 дней (в зависимости от приложения), иногда проверка реактора для надлежащего дренажа.
  7. Для уборки капельного биопленки проточного реактора, остановки насоса и осторожно удалить иглы из реактора. Реактор может быть помещена на ровную поверхность и купоны могут быть стерильно удалить с помощью стерильного пинцета. Если микроскопия желательно, купоны могут теперь быть обработаны соответствующим образом (Рисунок 2B является сканирующая электронная микрофотография биопленки золотистого стафилококка, выращенные в реакторе биопленки капельно). Если количественная оценка биомассы биопленки или физиологии исследования Целью исследования, биопленки могут быть удалены из купон с помощью мобильного скребком. Удерживая купоны с пинцетом, осторожно очистить биопленки с купоном в коническую трубку с фосфатным буферным раствором с помощью мобильного скребком. Примечание: для количественного колониеобразующих единиц в биопленки, необходимо для гомогенизации собрано биопленки с тканью гомогенизатор разбить сгустки и формы однородная суспензия. Различные модели ткани гомогенизаторы подходят для данного применения. Мы используем Fisher Scientific Tissuemiser Гомогенизатор (продукт # 15-338-420) на полной скорости в течение 1 минуты до однородности биопленки образцов. Невыполнение гомогенизации биопленки приведет к недооценке колониеобразующих единиц присутствуют в образце.

2. Вращающийся диск Реактор биопленки

  1. Вращающийся диск реактора биопленки (доступно из имеющихся технологий из Biosurface или может быть заказ, см. рисунок 3) собирается и в автоклаве. Сборка реактора первое место вращающийся диск купоны в слоты вращающегося диска и размещения его в 1-литровый стеклянный стакан с переполнением порт. Номер 15-резиновой пробкой с отверстиями в ней, чтобы рабочие среды и аэрации используется в качестве реактора шапку. Реактор, биопленки СМИ (триптического бульон соевый 2 г / л и глюкозы 2 г / л), и впускной трубопровод, затем стерилизовать в автоклаве.
  2. Вращающийся диск реактора биопленки засевают путем размещения 250 мл стерильной среды в реактор, и добавление 0,5 мл ночь С. золотистого культуры, выращенные в триптического бульон сои. Реактор помещается на мешалки установлена ​​в 250 оборотов в минуту и ​​инкубировали в течение ночи на желаемую температуру.
  3. После 16 часов инкубации подключить входной трубопровод до порта на среднем пласте и подключить его к перистальтического насоса. Насос затем включите и поток установлен в ~ 0,25 мл / мин (поток может быть изменена в зависимости от темпов роста желательно).
  4. Через 24 часа остановить реактор и асептически удалить диск, не касаясь биопленки купонов. Удалить купоны использованием стерильных щипцов и опустите каждый в фосфатным буферным солевым раствором, чтобы удалить какой-либо свободно прилагается бактерий.
  5. Для антимикробной соединение, чипы могут быть помещены в отдельные лунки 96-луночного планшета содержащих соединений, представляющих интерес. После инкубации, чипсы, переводятся в 1,5 мл микроцентрифужных пробирки, содержащие 1 мл фосфатного буфера физиологического раствора и гомогенизировали ткани гомогенизатор для разгона нетронутыми биопленки.
  6. Затем клетки серийный разбавляли и высевали на питательную среду агар для определения жизнеспособного колонии formiнг единиц.
  7. Обратите внимание: многие изменения могут быть сделаны по вышеуказанным протоколом. Например, вращающийся диск купоны могут быть покрыты или сделаны из потенциальных анти-биопленки соединений для проверки эффективности. Биопленка диспергаторы также может быть оценена быть инкубации купоны в диспергирующих соединений и количественной бактерий прилагается против отключения.

3. Представитель Результаты

Примером создана капельного реактора расход отображается, если рисунке 1. После трех дней поток обильное количество биопленки будет накапливаться на поверхности купон, на рисунке 2А. Общая биомасса будет варьироваться в зависимости от бактериальных штаммов и точные условия роста. Сканирующей электронной микрофотографии С. золотистого биопленки выращенных в реакторе потоком капельного показан на рисунке 2Б.

Вращающегося диска реактора показана на рисунке 3А. Протокол, описанный могут быть адаптированы к специфическим требованиям вообще кто-либо микроорганизм, способный образовывать биопленки. Рис 3B показывает, вращающийся диск с 18 пластиковыми дисками прикреплена. Эти дисков выросли биопленки особенно хорошо подходят для антимикробной и урожайность очень воспроизводимые результаты 11.

Рисунок 1
Рисунок 1. Капельного потока реактора установки. Важные компоненты маркированы.

Рисунок 2
Рисунок 2. Пример капельного потока С. золотистого биопленки. ) Это биопленки был выращен в течение трех дней после описанного протокола. Крышки от первых двух палат реактора удаляются, чтобы показать желтую С. биомассы золотистого биопленки. Б) Sacnning электронная микрофотография С. золотистого биопленки выращенных в реакторе потоком капельницу.

Рисунок 3
Рисунок 3. Реактор вращающегося диска. ) Пример работы вращающийся реактор диска. Ключевой компонент помечены. Б) Крупным планом зрения вращающийся диск.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Биопленки выращенных в различных реакторов будет часто имеют различные характеристики, и каждый реактор различных приложений. В этой работе мы описываем использование двух реакторов биопленки: биопленки капельного реактора потока и вращающегося диска реактора. Капельное реакторов поток полезны для растущего низкой скорости сдвига биопленки на воздух-жидкость и могут быть адаптированы к различным условиям. Мы находим их очень удобными для исследований, в которых большое количество биопленки биомассы является желательным. Эта установка может быть легко адаптирована для исследований с участием микросенсора мониторинга и тестирования потенциальных поверхностей antibiofilm.

Вращающегося диска реактора полезно для выращивания нескольких одинаковых биопленки на удаление дисков под умеренным сдвига среды. Способность этого реактора для производства нескольких одинаковых биопленки на съемных дисках делает его идеальным для исследований с участием тестирования антимикробных соединений и поверхности биопленки устойчивы. Многие приложения возможны при использовании этих биопленки реакторов и исследователям рекомендуется изменить протокол на лучшую модель их конкретных потребностей исследования.

Эти протоколы в качестве альтернативы ячейка потока и статического биопленки анализы, которые были использованы более широко в прошлом. Они могут также предоставлять более широкие возможности для имитации разнообразных клинических инфекций. Однако Есть потенциальные ограничения друг с техникой. Например, капельного потока реакторов и реакторов вращающийся диск не являются идеальными для визуализации биопленки с помощью конфокальной микроскопии. Кроме того, физиология биопленки выращенных в различных типах реакторов, скорее всего, сильно различаются. Например, капельно-проточного реактора приведет к биопленки подвергаясь тяжелым питательных градиенты, которая очень отличается от равномерного ламинарный поток питательных средах через биопленки ячейка потока. В конечном счете, тип реактора биопленки использовались будет зависеть от вопросов решается и следователи должны знать, что несколько систем реактора биопленки доступны для своих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

NIAID грант K22AI081748.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drip Flow Reactors BioSurface Technologies Corporation DFR 110
Rotating Disk Reactors BioSurface Technologies Corporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial Biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).
  2. Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. Bacterial biofilms in nature and disease. Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  3. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).
  4. Boles, B. R., Horswill, A. H. Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).
  5. Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).
  6. Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system. Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).
  7. Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. Biofilm resistance to antimicrobial agents. Microbiology. 146, 547-549 (2000).
  8. Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).
  9. Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).
  10. Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms. J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).
  11. Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms. Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).
  12. Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).
  13. Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).

Tags

Иммунологии выпуск 46 биопленки реактор капельного потока вращающийся диск реактора открытая система биопленки

Erratum

Formal Correction: Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. There was an error with an author's name. The author's middle initial was missing, this was corrected to:

Blaise R. Boles

instead of:

Blaise Boles.

Использование потоков для слива воды и вращающихся дисков для реакторов<em> Золотистый стафилококк</em> Биопленка Анализ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schwartz, K., Stephenson, R.,… More

Schwartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. J. Vis. Exp. (46), e2470, doi:10.3791/2470 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter