ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Damla akış reaktörleri, açık sistem akış biyofilm kullanan ve diski reaktörler dönen için Protokoller ayrıntılı olarak sunulmuştur.
Abstract
Doğada en çok mikrop 1 Bakteriyel biyofilm bir matriks içinde kaplı. Biyofilm yüzey ile ilişkili topluluklar gibi mevcut düşünce ve bir yüzey 2 Biyofilm oluşumu ve gelişimi bağlı yaygın microtiter plakalar veya akış gibi toplu sistemlerini kullanarak laboratuvarda incelenir sistemleri, akış hücreleri gibi. Bu metodolojileri mutant ve kimyasal kütüphaneleri (microtiter plakalar) görselleştirme (akış hücreleri) 4 için 3 ya da büyüyen biyofilm tarama için yararlıdır. Damla akışı biyofilm reaktörü ve dönen disk biyofilm reaktörü: Burada iki ek tip akış sistemi biyofilm büyüyen Staphylococcus aureus için ayrıntılı protokolleri mevcut.
Damla akış biyofilm reaktörleri düşük kesme koşulları altında yetiştirilen biyofilm çalışma için tasarlanmış dört paralel test kanalları, her bir standart cam mikroskop lamı büyüklüğünde kupon tutma kapasitesine sahip, ya da bir kateter ya da çalıştıktan uzunluğu 5 damla akış reaktör oluşur . Damla akış reaktör mikrosensor izleme, genel biyofilm çalışmaları, biyofilm cryosectioning örnekleri, yüksek biyokütle üretimi, tıbbi malzeme değerlendirmeler ve kalıcı bir tıbbi cihazın denenmesi için idealdir. 6,7,8,9
Dönen disk reaktör, çıkarılabilir kuponlar için girinti içeren bir teflon disk oluşur. Çıkarılabilir 10 kupon yazan işlenebilir herhangi bir malzemeden yapılmış olabilir. Dönen disk alt diskin dönme yüzey yıkama kuponlar arasında sıvı yüzey kesme oluşturmak için izin veren bir çubuk mıknatıs içerir. 18 kupon içeren tüm disk, 1000 ml'lik cam yan kol reaktör damar yerleştirilir. Disk, manyetik karıştırıcı ile döndürülmüş ise sıvı bir büyüme ortamı gemi dolaşıyor. Kupon reaktör damarı çıkarılmış ve ardından daha fazla çalışma veya mikroskopi görüntüleme biyofilm örnek toplamak için kazınır. Döner disk reaktörler biyosit etkinlik, biyofilm kaldırılması ve anti-kirlenme malzemeleri performans laboratuvar değerlendirmeler için tasarlanmıştır. 9,11,12,13
Protocol
1. Damla Akış Biyofilm Reaktörü
- Damla akış biyofilm reaktörü monte edilmiş ve otoklava (Biosurface Technologies ya da özel olarak tasarlanmış sürümleri mevcuttur genellikle üniversite makine atölyeleri tarafından yapılabilir, bkz. Şekil 1). Meclis odaları ve güvence odasına kapakları iliştirilmesi kupon içerir. Biyofilm orta (triptik soy broth 2 gram / L ve glukoz 2 gram / L) ve akma besin boru ile birlikte odası, otoklav ile sterilize edilir.
- Damla akış reaktör, reaktör, düz bir yüzey üzerine yerleştirerek, atık su boru hatları sıkma, 10 ml triptik soy broth her odasını doldurmak ve S. 10 mcL ekleyerek Aşılama preformed. aureus kültürü triptik soy broth gecede büyüdü. Inoküle reaktör daha sonra 18 saat boyunca 37 ° C inkübatör yerdir.
- 18 saat inkübasyondan sonra, atık su boru unclamped ve reaktör, 10 derecelik açıyla kesilmiş ahşap bir blok üzerine yerleştirilir.
- Aseptik sürekli akış besin suyu şişesi gibi geleneksel besin hortumu bağlayın. Maksimum hız (pompa modeline göre değişir) pompa çalıştırarak, pompa ve başbakan tüpler aracılığıyla boru hattı besleyin.
- Akma boru, pompa durdurmak ve her tüp sonuna kadar bağlantı iğne (22 gauge, 1 inç) eklemek astarlanmalıdır. Etanol silin ve aseptik giriş stoper üzerinden iğne eklemek odasına giriş stoper silin.
- Pompa açın ve kuponlar üzerinde (akış hızı ~ 125 mcL / dakika) medya yavaş yavaş damla izin. Medya giriş stoper limandan çıkış portuna kupon boyunca aşağıya doğru akmalıdır. Bazen uygun drenaj için reaktör kontrol, 2-5 gün (uygulamaya bağlı olarak) sürekli akış reaktör çalıştırın.
- Damla akış reaktör biyofilm hasat için, pompayı durdurun ve reaktör dikkatle iğneleri çıkarın. Reaktör daha sonra düz bir yüzeye yerleştirilir ve kuponlar aseptik olarak steril forseps kullanılarak silinebilir. Mikroskopi isteniyorsa, kuponlarını buna göre işlenmiş olabilir (Şekil 2B bir damla biyofilm reaktörde yetişen bir S. aureus biyofilm bir tarama elektron mikrografı). Biyofilm biyokütle veya fizyoloji çalışmaları ölçümü çalışmanın amacı ise, biyofilm bir hücre kazıyıcı kullanarak kupon silinebilir. Forseps ile kupon tutarken, fosfat içeren konik bir tüp içine yavaşça kupon kapalı biyofilm kazımak bir hücre kazıyıcı kullanarak tamponlu salin. Not: biyofilm koloni oluşturan birim ölçmek için, kümeleri parçalara ayırma ve homojen bir süspansiyon formu Homojenizatör bir doku ile hasat biyofilm homojenize gereklidir. Çeşitli modeller doku homojenizatörler bu uygulama için uygundur. Biyofilm örnekleri homojenize 1 dakika boyunca tam hızda bir Fisher Scientific Tissuemiser Homojenizatör (ürün # 15-338-420) kullanmaktadır. Biyofilm homojenize yapılmaması örnek mevcut birimleri oluşturan koloni küçümsenmesi neden olacaktır.
2. Döner Disk Biyofilm Reaktörü
- Dönen disk biyofilm reaktörü (yapılan bkz. Şekil 3 Biosurface Teknolojileri temin edinilebilir veya özel olabilir) toplandı ve otoklava. Ilk etapta reaktör birleştirin yuvalarına dönen diskin disk kupon iplik ve bir taşma bağlantı noktası ile 1 litrelik cam beher içine yerleştirerek. Medya akış ve havalandırma sağlamak için delikli bir dizi 15-lastik tıpa reaktör kap olarak kullanılır. Reaktör, biyofilm medya (triptik soy broth 2 g / L ve glukoz 2 g / L), ve giriş boruları, daha sonra otoklav ile sterilize edilir.
- Dönen disk biyofilm reaktör, reaktör içine 250 mL steril ortamda koyarak inoküle ve bir gecede S. 0,5 mL ekleyerek aureus kültürü triptik soy broth yetiştirilen. Reaktör sonra, 250 rpm bir heyecan plaka üzerine yerleştirilir ve istenilen sıcaklıkta gece inkübe edilir.
- 16 saat inkübasyondan orta rezervuar giriş boru bağlantı noktasına bağlamak ve peristaltik pompa bağlamak sonra. Pompa daha sonra açmak ve akış ~ 0.25 ml / dak (akış istenilen büyüme hızına bağlı olarak değiştirilebilir).
- 24 saat sonra reaktör durdurmak ve aseptik biyofilm kupon dokunmadan diski çıkarın. Kuponları steril forseps kullanarak çıkarın ve fosfat içine her bir dip gevşek bağlı herhangi bir bakteri kaldırmak için tamponlu salin.
- Antimikrobiyal bileşik testi için, cips ilgi bileşikleri içeren bir 96 plaka ayrı ayrı kuyu içine yerleştirilir. Inkübasyondan sonra, cips, 1 ml fosfat tamponu tuzlu su içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine aktarılır ve bir doku bozulmadan biyofilm dağıtmak için homojenizatör ile homojenize.
- Hücreler daha sonra seri seyreltilmiş ve canlı koloni formi belirlemek için besin agar üzerine kaplamang birimleri.
- Not: Yukarıdaki protokol çok varyasyon yapılabilir. Örneğin, dönen disk kuponlar ile kaplı olabilir ya da etkinliğini test etmek için potansiyel anti-biyofilm bileşikler yapılmış. Biyofilm dispersant dağıtıcı bileşikler ve ekli karşı müstakil bakteri miktarının belirlenmesi kupon kuluçka olarak değerlendirilebilir.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 ise damla akış reaktör kadar bir dizi bir örnek gösterilmiştir. Biyofilm bol miktarda akışı üç gün sonra, kupon yüzeyi, Şekil 2A üzerinde birikir. Toplam biyokütle bakteri suşu ve hassas bir büyüme şartlarına bağlı olarak değişir. S. taramalı elektron mikrografı Şekil 2B damla akış reaktör yetiştirilen aureus biyofilm gösterilmiştir.
Dönen bir disk reaktör rakam 3A gösterilmiştir. Açıklanan protokol, bir biyofilm oluşturma yeteneğine sahip, genellikle herhangi bir mikroorganizmanın özel gereksinimlerine adapte edilebilir. Şekil 3B 18 plastik diskler yapıştırılmış iplik disk gösterir. Bu disk yetiştirilen biyofilm, özellikle de antibiyotik testi için uygun ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar 11 verim .
Şekil 1 damla akım reaktöründe kurulum. Önemli bileşenleri etiketlenir.
Şekil 2: Örnek bir damla akışı S. aureus biyofilm. A) Bu biyofilm açıklanan protokol izleyen üç gün için yetiştirilir. Kapaklar reaktörün ilk iki odalarından sarı S. göstermek için kaldırılır aureus biyofilm biyokütle. S. B) Sacnning elektron mikrografı aureus biyofilm damla akış reaktöründe büyüdü.
Şekil 3 Dönen disk reaktör. A) Örnek dönen disk çalışan bir reaktör. Anahtar bileşeni olarak etiketlenir. B) dönen bir disk kapatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farklı reaktörler yetiştirilen Biyofilmler genellikle farklı özelliklere sahip olacak ve her reaktör farklı uygulamalar vardır. Bir damla akış biyofilm reaktörü ve dönen bir disk reaktör: Bu çalışmada, iki biyofilm reaktörlerin kullanımı açıklanmaktadır. Damla akış reaktörleri düşük bir hava-sıvı arayüzü kesme biyofilm yetiştirmek için yararlı olan ve çeşitli koşullara uyarlanabilir. Biz büyük bir miktarda biyofilm biyokütle arzu edilir çalışmaları için son derece kullanışlı bulabilirsiniz. Bu kurulum mikrosensor potansiyel antibiofilm yüzeyler izleme ve test içeren çalışmalar için kolayca adapte edilebilir.
Dönen disk reaktör, ılımlı bir kesme ortamı altında kaldır disk üzerinde birden fazla özdeş biyofilm büyüme için yararlıdır. Çıkarılabilir disk üzerinde birden fazla özdeş biyofilm üretmek için bu reaktör yeteneğini test antimikrobiyal bileşikler ve biyofilm dayanıklı yüzeyler içeren çalışmalar için ideal hale getirir. Birçok uygulama, bu biyofilm reaktörleri ve araştırmacıların en iyi model kendi özel araştırma ihtiyaçlarını protokolü değiştirmek için teşvik edilir mümkündür.
Bu protokoller akış hücresi ve geçmişte daha yaygın olarak kullanılan statik testleri biyofilm alternatifler sağlar. Ayrıca çeşitli klinik enfeksiyonlarda taklit etmek için daha büyük bir yeteneği sağlayabilir. Ancak, her iki tekniğin potansiyel sınırlamalar vardır. Örneğin, damla akış reaktörleri ve dönen diskin reaktörler konfokal mikroskobu ile biyofilm görselleştirmek için ideal değildir. Ayrıca, reaktör farklı türde yetişen biyofilm fizyolojisi, muhtemelen büyük ölçüde değişecektir. Örneğin, damla akım reaktöründe bir akış hücresi biyofilm boyunca besin medya düzgün laminar akış çok farklı bir biyofilm, şiddetli besin gradyanlar maruz kalma ile sonuçlanabilir. Sonuçta, kullanılan biyofilm reaktör tipi sorular ele alınmaktadır bağlı olacak ve araştırmacılar birden fazla biyofilm reaktör sistemleri kendi çalışmaları için mevcut olduğunun farkında olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
NIAID hibe K22AI081748.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drip Flow Reactors | BioSurface Technologies Corporation | DFR 110 | |
| Rotating Disk Reactors | BioSurface Technologies Corporation |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. Bacterial biofilms in nature and disease. Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).
- Boles, B. R., Horswill, A. H. Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).
- Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).
- Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system. Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).
- Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. Biofilm resistance to antimicrobial agents. Microbiology. 146, 547-549 (2000).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).
- Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms. J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms. Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).
- Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).
- Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).
Tags
İmmünoloji Sayı 46 biyofilm damla akış reaktör dönen diskin reaktör açık sistem biyofilmErratum
Formal Correction: Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011.
Citeable Link.
A correction was made to The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. There was an error with an author's name. The author's middle initial was missing, this was corrected to:
Blaise R. Boles
instead of:
Blaise Boles.
