Die Verwendung von Drip Flow und Rotating Disk-Reaktoren für Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Summary

Protokolle für die Nutzung offenes System fließen Biofilmen mit Tropf Strömungsreaktoren und rotierenden Scheibe Reaktoren sind im Detail vorgestellt.

Abstract

Die meisten Mikroben in der Natur gedacht, als Aufputz-assoziierten Gemeinschaften in Biofilmen existieren. ¹ Bakterielle Biofilme sind in einer Matrix umgeben und an einer Oberfläche. ² Biofilmbildung und Entwicklung sind häufig im Labor mit der Batch-Systeme, wie Mikrotiterplatten oder Durchfluss studiert Systeme, wie zB Flow-Zellen. Diese Methoden sind nützlich für das Screening von Mutanten und chemischen Bibliotheken (Mikrotiterplatten) ³ oder wachsende Biofilme zur Visualisierung (flow-Zellen) ^4. Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Protokolle für den Anbau von Staphylococcus aureus in zwei weitere Arten von Flow-System Biofilme: die Tropf-Flow Biofilmreaktor und der rotierenden Scheibe Biofilmreaktor.

Drip flow Biofilm Reaktoren sind für die Untersuchung von Biofilmen unter geringer Scherung Bedingungen angebaut konzipiert. ⁵ Der Tropf Reaktor besteht aus vier parallelen Test-Kanäle, einer Kapazität von jeweils einem Standard-Glasobjektträger großen Coupon oder eine Länge von Katheter oder Stint. Die Tropf-Flow-Reaktor ist ideal für Mikrosensorik Überwachung, allgemeine Biofilm Studien, Biofilm Kryoschneiden Proben, hohe Produktion von Biomasse, medizinisches Material Auswertungen und innewohnenden medical device testing. ^6,7,8,9

Die rotierende Scheibe Reaktor besteht aus einem Teflon-Platte mit Aussparungen für herausnehmbare Coupons. ¹⁰ Die herausnehmbare Coupons können von jedem zerspanbaren Material. Der Boden der rotierenden Scheibe enthält einen Stabmagneten, damit Plattenrotation zu Flüssigkeitsoberfläche Scher über flächenbündige Coupons zu erstellen. Die gesamte Festplatte mit 18 Coupons ist in einem 1000 mL Glas Seitenarm Reaktor vorgelegt. Eine flüssige Nährmedien wird durch den Behälter zirkuliert, während die Festplatte durch einen Magnetrührer gedreht wird. Die Coupons werden aus dem Reaktor entnommen und dann abgeschabt, um den Biofilm Probe für weitere Untersuchungen oder Mikroskopie zu sammeln. Rotating Disc Reaktoren sind für Laboruntersuchungen von Biozid-Wirksamkeit, Biofilmentfernung und Leistung von Anti-Fouling-Materialien entwickelt. ^9,11,12,13

Protocol

1. Die Drip Flow-Biofilm-Reaktor

1. Die Tropf-Flow Biofilmreaktor (erhältlich bei Biosurface Technologies oder kundenspezifische Versionen können in der Regel von der Universität Werkstätten vorgenommen werden, siehe Abbildung 1) montiert ist und autoklaviert. Montage beinhaltet das Anbringen Coupons in Kammern und Sicherung Kammer Deckel. Die Kammer, zusammen mit Biofilm Medium (CASO-Bouillon 2 g / L und Glucose 2 g / L) und Zulauf Nährstoff-Rohren werden durch Autoklavieren sterilisiert.
2. Beimpfung des Tropf Reaktor wird erreicht, indem der Reaktor auf eine flache Oberfläche, Klemmung des Abwassers Schlauchleitungen, Abfüllung jeder Kammer mit 10 ml CASO-Bouillon und Zugabe von 10 ul einer S. vorgeformten aureus Kultur über Nacht in CASO-Bouillon gewachsen. Die beimpften Reaktor wird dann in einem 37 ° C Inkubator Platz für 18 Stunden.
3. Nach 18 Stunden Inkubationszeit wird das Abwasser Rohr abgeklemmt und der Reaktor auf einen Holzblock geschnitten, um eine 10 °-Winkel angeordnet.
4. Aseptisch verbinden Zulauf Nährstoff Schlauch an der Flasche mit der kontinuierlichen Nährlösung. Feed the Rohrleitung durch die Pumpe und prime die Rohre, indem Sie die Pumpe mit einer maximalen Geschwindigkeit (variiert je nach Pumpentyp).
5. Sobald der Zulauf-Schlauch ist grundiert Stopp der Pumpe und befestigen Sie verbinden Nadeln (22 Gauge, 1 Zoll) bis zum Ende jeder Röhre. Wischen Sie die Kammereinlass Stopfen mit einem Ethanol-Wisch-und aseptisch legen Sie die Nadeln durch den Einlass Stopper.
6. Schalten Sie die Pumpe und lassen Sie die Medien langsam tropft (Durchfluss bis 125 ul / Minute) über die Coupons. Die Medien sollten nach unten entlang der Kupon vom Einlass Anschlag Anschluss an das Abwasser-Anschluss. Betreiben Sie den Reaktor in kontinuierlichen Fluss für 2-5 Tage (je nach Anwendung), gelegentlich die Überprüfung der Reaktor für eine ordnungsgemäße Entwässerung.
7. Zur Ernte der Tropf Reaktor Biofilmen, die Pumpe stoppen und entfernen Sie vorsichtig die Nadeln aus dem Reaktor. Der Reaktor kann dann auf einer ebenen Fläche aufgestellt werden und die Coupons können aseptisch entfernt werden mit einer sterilen Pinzette. Wenn Mikroskopie ist erwünscht, die Coupons können nun entsprechend verarbeitet werden (Abbildung 2B ist eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer S. aureus Biofilm in einen Tropf Biofilmreaktor gewachsen). Wenn die Quantifizierung des Biofilms Biomasse oder Physiologie Studien das Ziel der Studie sind, kann der Biofilm aus den Coupon mit einem Zellschaber entfernt werden. Halten Sie die Coupons mit einer Pinzette vorsichtig abkratzen der Biofilm aus den Coupon in einem konischen Rohr mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit einem Zellschaber. Hinweis: Zur Quantifizierung der Kolonie-bildenden Einheiten in den Biofilmen, ist es notwendig, die geerntet Biofilmen mit einem Gewebe-Homogenisator zu Klumpen disaggregate und bilden eine homogene Suspension zu homogenisieren. Verschiedene Modelle von Gewebe Homogenisatoren werden für diese Anwendung geeignet. Wir verwenden eine Fisher Scientific Tissuemiser Homogenisator (Produkt # 15-338-420) bei voller Geschwindigkeit für 1 Minute bis Biofilm Proben zu homogenisieren. Die Nichtbeachtung der Biofilm homogenisieren wird in einer Unterschätzung der Kolonie bildenden Einheiten in der Probe vorhanden führen.

2. Die rotierende Scheibe Biofilm Reactor

1. Die rotierende Scheibe Biofilmreaktor (erhältlich bei erhältlich Biosurface Technologies oder können nach Maß, siehe Abbildung 3) montiert ist und autoklaviert. Montieren Sie den Reaktor durch den ersten Platz die sich drehende Scheibe Coupons in die Schlitze der drehenden Scheibe und legte sie in einen 1-Liter Becherglas mit einem Überlauf-Anschluss. Eine Reihe 15-Gummistopfen mit Löchern darin gebohrt, um Fördermedien-und Entlüftung zu ermöglichen, da der Reaktor Kappe verwendet. Der Reaktor, Biofilm Medien (CASO-Bouillon 2 g / L und Glucose 2 g / L) und Zulaufschlauch werden dann durch Autoklavieren sterilisiert.
2. Die rotierende Scheibe Biofilmreaktor ist, indem 250 ml des sterilen Mediums in den Reaktor geimpft und Zugabe von 0,5 ml einer Übernachtkultur S. aureus Kultur in CASO-Bouillon gewachsen. Der Reaktor wird dann auf einer Rührplatte auf 250 rpm gestellt und über Nacht bei der gewünschten Temperatur.
3. Nach 16 Stunden Inkubationszeit verbinden Sie den Zulaufschlauch mit dem Anschluss auf mittlere Reservoir und verbinden Sie es mit der Schlauchpumpe. Die Pumpe wird dann auf Turn und Fluss auf ~ 0,25 ml / min (Durchfluss kann je nach Wachstum gewünscht verändert werden).
4. Nach 24 Stunden beenden den Reaktor und aseptisch entnehmen Sie die Disc, ohne den Biofilm-Coupons. Entfernen Sie die Coupons mit einer sterilen Pinzette und tauchen jeweils in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung keine lose Bakterien zu entfernen.
5. Für antimikrobielle Verbindung testen, können die Chips in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit Verbindungen von Interesse platziert werden. Nach der Inkubation werden Chips in 1,5 ml Reaktionsgefäßen mit 1 mL Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung überführt und homogenisiert mit einem Gewebe-Homogenisator auf den intakten Biofilm zu zerstreuen.
6. Die Zellen werden dann seriell verdünnt und ausplattiert auf Nähragar Medium, um lebensfähige Kolonie Formi bestimmenng Einheiten.
7. Hinweis: viele Varianten finden Sie auf der oben genannten Protokoll vorgenommen werden. Zum Beispiel kann sich drehende Scheibe Coupons mit beschichtet werden oder ausgefertigten potenzieller Anti-Biofilm-Verbindungen, um die Wirksamkeit zu testen. Biofilm Dispergiermittel können auch ausgewertet werden Inkubation Coupons in Dispergiermittel Verbindungen und Quantifizierung von Bakterien angebracht gegenüber abgenommen werden.

3. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für eine Einrichtung Tropf Reaktor ist, wenn Abbildung 1 dargestellt. Nach drei Tagen fließen reichlich Biofilm wird auf dem Coupon Oberfläche, 2A akkumulieren. Die gesamte Biomasse ist abhängig von Bakterienstämmen und präzise Wachstumsbedingungen. Eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines S. aureus Biofilm in den Tropf Reaktor aufgewachsen ist in Abbildung 2B gezeigt.

Eine rotierende Scheibe Reaktor ist in Abbildung 3A gezeigt. Das Protokoll beschrieben, kann auf die spezifischen Anforderungen in der Regel keine Mikroorganismus, der Bildung eines Biofilms angepasst werden. Abbildung 3B zeigt die sich drehende Scheibe mit 18 Kunststoff-Platten angebracht. Diese Platte gewachsenen Biofilmen sind besonders gut für antimikrobielle Tests geeignet und liefern gut reproduzierbare Ergebnisse ^11.

Abbildung 1. Der Tropf Reaktor-Setup. Wichtige Komponenten sind beschriftet.

Abbildung 2. Beispiel für einen Tropf flow S. aureus Biofilm. A) Dieser Biofilm wurde drei Tage nach dem beschriebenen Protokoll gewachsen. Deckel aus den ersten beiden Kammern des Reaktors entfernt werden, um die gelbe S. zeigen aureus Biofilm Biomasse. B) Sacnning elektronenmikroskopische Aufnahme eines S. aureus Biofilm in den Tropf Reaktor aufgewachsen.

Abbildung 3. Die rotierende Scheibe Reaktor. A) Beispiel für ein laufendes Spinning-Disk-Reaktor. Key-Komponente gekennzeichnet sind. B) Nahaufnahme einer sich drehenden Scheibe.

Discussion

Biofilme in verschiedenen Reaktoren gezüchtet wird, haben oft unterschiedliche Eigenschaften und jeden Reaktor verfügt über verschiedene Anwendungen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Verwendung von zwei Biofilmreaktoren: einen Tropf flow Biofilmreaktor und einer rotierenden Scheibe Reaktor. Drip Strömungsreaktoren sind nützlich für den Anbau von geringer Scherung Biofilmen bei einem Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche und sind für eine Vielzahl von Bedingungen. Wir finden sie sehr bequem für Studien, in denen eine große Menge von Biofilm Biomasse ist wünschenswert. Diese Konfiguration kann leicht für Studien mit Mikrosensor Überwachung und Prüfung von potenziellen Antibiofilm Oberflächen angepasst werden.

Die rotierende Scheibe Reaktor ist nützlich für den Anbau von mehreren identischen Biofilm auf Scheiben entfernen, unter mäßiger Scherung Umwelt. Die Fähigkeit dieses Reaktors mit mehreren identischen Biofilmen auf Wechseldatenträgern zu produzieren macht es ideal für Studien, die die Prüfung der antimikrobiellen Verbindungen und Biofilm Oberflächen. Viele Anwendungen sind möglich, wenn die Verwendung dieser Biofilm-Reaktoren und Forscher sind aufgefordert, das Protokoll beste Modell ihrer spezifischen Forschungsbedarf zu ändern.

Diese Protokolle bieten Alternativen zu Durchflusszelle und statische Tests Biofilmen, die verwendet wurden in größerem Umfang in der Vergangenheit. Sie können darüber hinaus eine größere Fähigkeit, diverse klinische Infektionen imitieren. Allerdings gibt es potenzielle Einschränkungen bei jeder Technik. Zum Beispiel sind die Tropf-Flow-Reaktoren und rotierenden Scheibe Reaktoren nicht ideal für die Visualisierung von Biofilmen durch konfokale Mikroskopie. Auch die Physiologie von Biofilmen in den verschiedenen Typen von Reaktoren aufgewachsen wahrscheinlich stark variieren. Zum Beispiel wird die Tropf-Flow-Reaktor in einem Biofilm freigelegt schweren Nährstoff-Gradienten, die ganz anders als die einheitliche Laminar-Flow von Nährmedien in einer Durchflusszelle Biofilm führen. Letztendlich wird die Art der Biofilm-Reaktor eingesetzt auf die Fragen angesprochen hängen und Ermittler sollten sich bewusst sein, dass mehrere Biofilmreaktor Systeme für ihre Studien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drip Flow Reactors	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
Rotating Disk Reactors	BioSurface Technologies Corporation