ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
وتعرض لاستخدام بروتوكولات مفتوحة مع نظام الأغشية الحيوية تدفق مفاعلات تدفق بالتنقيط والدورية المفاعلات القرص بالتفصيل.
Abstract
ويعتقد أن معظم الميكروبات في الطبيعة في الوجود والسطحية المصاحبة للمجتمعات المحلية في الأغشية الحيوية. 1 الأغشية الحيوية الجرثومية المغطى داخل مصفوفة وتعلق على تشكيل سطح الأرض. بيوفيلم 2 والتنمية تدرس عادة في المختبر باستخدام نظم الدفعي مثل لوحات أو تدفق microtiter نظم ، مثل خلايا التدفق. هذه المنهجيات هي مفيدة لفحص المكتبات متحولة والكيميائية (لوحات microtiter) 3 أو الأغشية الحيوية المتنامية للمرئيات (خلايا تدفق) 4. هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية عن المكورات العنقودية الذهبية المتزايد في نوعين من الأغشية الحيوية إضافية نظام التدفق : بيوفيلم في تدفق مفاعل بالتنقيط وبيوفيلم القرص مفاعل بالتناوب.
تم تصميم المفاعلات بالتنقيط تدفق بيوفيلم لدراسة الأغشية الحيوية نمت في ظل ظروف القص منخفضة. بالتنقيط تدفق 5 المفاعل يتكون من أربع قنوات اختبار بالتوازي مع ذلك ، كل قادر على عقد one ميكروسكوب القسيمة الشريحة القياسية الحجم ، أو طول قسطرة أو مهمة. المفاعل بالتنقيط تدفق مثالية لرصد microsensor ، الدراسات العامة بيوفيلم ، وعينات بيوفيلم cryosectioning ، وارتفاع إنتاج الكتلة الحيوية ، وتقييم المواد الطبية ، وسكنى اختبار الجهاز الطبي. 6،7،8،9
المفاعل القرص الدورية يتكون من قرص يحتوي على تجاويف للتفلون القسائم القابلة للإزالة. القسائم القابلة للإزالة (10) التي يمكن من أي مادة ألالة. الجزء السفلي من قرص يحتوي على المغناطيس الدورية للسماح للشريط تناوب على القرص لإنشاء القص السائل عبر سطح سطح دافق القسائم. يوضع القرص بأكمله يحتوي على 18 قسيمة في كوب مل 1000 سفينة المفاعل الجانبية الذراع. ويتم توزيع وسائل الاعلام من خلال النمو السائل السفينة في حين يتم تدوير القرص من قبل النمام المغناطيسي. تتم إزالة القسائم من السفينة المفاعل ثم كشط لجمع عينة بيوفيلم لمزيد من الدراسة أو التصوير المجهري. تم تصميم المفاعلات القرص الدورية لتقييم كفاءة المختبر بالطرق البيولوجية ، وإزالة بيوفيلم ، وأداء المواد المانعة للقاذورات. 9،11،12،13
Protocol
1. وبيوفيلم بالتنقيط تدفق مفاعل
- وبيوفيلم تدفق مفاعل بالتنقيط (يمكن عادة ما تكون متاحة من تقنيات Biosurface أو العرف تصميم إصدارات أن تدلي بها محلات آلة الجامعة ، انظر الشكل 1) يتم تجميعها وتعقيمها. ويشمل التجمع كوبونات الالصاق في الغرف وغرفة أغطية تأمين. يتم تعقيم الغرفة ، جنبا إلى جنب مع بيوفيلم المتوسطة (مرق الصويا تريبسيني 2 غرام / لتر والجلوكوز 2 غرام / لتر) ، وأنابيب المغذيات مؤثر من قبل التعقيم.
- غير متشكلة تلقيح من مفاعل بالتنقيط تدفق من خلال وضع المفاعل على سطح مستو ، خطوط أنابيب لقط النفايات السائلة ، وتعبئة كل غرفة مع 10 مل من مرق الصويا زيتية واضاف ان 10 ميكرولتر من س. ثقافة المذهبة نمت بين عشية وضحاها في مرق الصويا زيتية. المفاعل تلقيح هي المكان ثم في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
- بعد 18 ساعة من الحضانة ، هو غير مثبت في أنابيب مياه الصرف ويتم وضع المفاعل على كتلة خشبية خفض إلى زاوية 10 درجة.
- توصيل أنابيب جو معقم و مطهر مؤثر المغذيات إلى زجاجة تحتوي على مغذيات التدفق المستمر مرق. تغذية خط الأنابيب من خلال مضخة وأنابيب للرئيس عن طريق تشغيل المضخة على أقصى سرعة (سوف تختلف تبعا لنموذج المضخة).
- مرة واحدة وتستعد للأنابيب مؤثر وقف الضخ ونعلق إبر الاتصال (22 المقياس ، 1 بوصة) إلى نهاية كل أنبوب. مسح سدادة مدخل الغرفة مع الايثانول مسح وإدراج جو معقم و مطهر الإبر عن طريق سدادة المدخل.
- بدوره على مضخة والسماح لوسائل الإعلام لبالتنقيط ببطء (معدل التدفق ~ 125 ميكرولتر / دقيقة) خلال القسائم. وينبغي أن تدفق وسائل الاعلام الهابط على القسيمة من ميناء سدادة مدخل الى ميناء المخلفات السائلة. تشغيل المفاعل في التدفق المستمر لمدة 2-5 أيام (اعتمادا على التطبيق) ، والتحقق من حين لآخر لمياه الصرف المفاعل المناسب.
- حصاد الأغشية الحيوية مفاعل بالتنقيط تدفق ، ووقف وإزالة مضخة بعناية الإبر من المفاعل. ويمكن بعد ذلك المفاعل يتم وضعها على سطح مستو ، ويمكن أن تكون القسائم إزالة جو معقم و مطهر باستخدام ملقط معقم. إذا كان المطلوب المجهري ، ويمكن الآن كوبونات يمكن معالجتها وفقا لذلك (الشكل 2B هو صورة مجهرية الإلكترون المسح من بيوفيلم S. المذهبة نمت في مفاعل بيوفيلم بالتنقيط). إذا كان تقدير حجم الكتلة الحيوية بيوفيلم أو دراسات علم وظائف الأعضاء والهدف من هذه الدراسة ، يمكن إزالة بيوفيلم من القسيمة باستخدام مكشطة الخلية. مخزنة في حين عقد كوبونات بالملقط ، كشط بلطف بيوفيلم كوبون في أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على الفوسفات المالحة باستخدام مكشطة الخلية. ملاحظة : لقياس مستعمرة في الأغشية الحيوية ، فمن الضروري أن التجانس في الأغشية الحيوية التي تحصد بمنديل الخالط إلى تفصيل وتشكيل كتل تعليق متجانسة. نماذج مختلفة من الأنسجة التجانس هي مناسبة لهذا التطبيق. علينا الاستفادة من العلم فيشر Tissuemiser الخالط (المنتج # 15-338-420) بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة لعينات بيوفيلم التجانس. وعدم التجانس في بيوفيلم يؤدي إلى التقليل من مستعمرة موجودة في العينة.
2. وقرص دائري مفاعل بيوفيلم
- يتم تجميعها في بيوفيلم القرص الدورية مفاعل (متاح من تقنيات المتاحة من Biosurface أو يمكن أن تكون مصنوعة من العرف ، انظر الشكل 3) وتعقيمها. تجميع المفاعل المقام الأول عن طريق الغزل كوبونات القرص في فتحات من القرص الغزل ووضعه في كوب زجاج 1 لتر مع منفذ تجاوز. ويستخدم عدد 15 سدادة مطاطية مع حفر ثقوب في ذلك إلى السماح لوسائل الإعلام والتهوية وتدفق سقف المفاعل. المفاعل ، بيوفيلم وسائل الإعلام (مرق الصويا تريبسيني 2 غرام / لتر والجلوكوز 2 غرام / لتر) ثم يتم تعقيم ، ومدخل الأنبوب بواسطة التعقيم.
- هو تحصين للبيوفيلم القرص الدورية المفاعل من خلال وضع 250 مليليتر من المتوسط العقيمة في المفاعل ، وإضافة 0.5 مل من S. بين عشية وضحاها ثقافة المذهبة التي تزرع في مرق الصويا زيتية. ثم يتم وضع المفاعل على طبق من اثارة تعيين إلى 250 دورة في الدقيقة والمحتضنة ليلا لدرجة الحرارة المطلوبة.
- بعد 16 ساعة من الحضانة توصيل الأنابيب لمدخل الميناء على خزان والمتوسطة وذلك لربط مضخة تمعجية. المضخة هو بدوره بعد ذلك على تدفق وتعيين إلى 0.25 مل ~ / دقيقة (يمكن تغييرها تدفق يتوقف على معدل النمو المنشود).
- بعد 24 ساعة من وقف المفاعل وإزالة جو معقم و مطهر القرص دون لمس كوبونات بيوفيلم. مخزنة إزالة القسائم باستخدام ملقط معقم وتراجع كل واحد في المياه المالحة الفوسفات لإزالة أي بكتيريا فضفاضة يعلق.
- لاختبار المركب المضادة للميكروبات ، يمكن وضع رقائق في الآبار الفردية 96 لوحة تحتوي على مركبات جيدا من الاهتمام. بعد الحضانة ، يتم نقلها إلى 1.5 رقائق أنابيب microcentrifuge مل تحتوي على 1 مل المالحة العازلة الفوسفات ومتجانسة مع النسيج الخالط لتفريق بيوفيلم سليمة.
- مخففة ثم الخلايا المسلسل ومطلي على المغذيات آجار المتوسطة لتحديد قابلة للحياة formi مستعمرةنانوغرام وحدة.
- ملاحظة : يمكن إجراء العديد من الاختلافات حول البروتوكول أعلاه. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون مغلفة كوبونات القرص الغزل مع أو مصنوعة من المركبات المضادة للبيوفيلم المحتملة لاختبار نجاعة. ويمكن أيضا أن يتم تقييم المشتتات بيوفيلم أن تفرخ القسائم في المركبات مشتتة والبكتيريا الكمي المرفقة مقابل منفصلة.
3. ممثل النتائج
ويرد مثال على انشاء مفاعل تدفق بالتنقيط إذا الشكل 1. بعد ثلاثة أيام من تدفق سوف مبالغ طائلة من بيوفيلم تتراكم على سطح القسيمة ، 2A الشكل. فإن مجموع الكتلة الحيوية تختلف باختلاف السلالات البكتيرية وظروف النمو دقيقة. A صورة مجهرية الإلكترون المسح من س. ويرد بيوفيلم المذهبة التي تزرع في مفاعل بالتنقيط تدفق 2B في الشكل.
ويرد في مفاعل القرص الدورية 3A الرقم. ويمكن تكييف البروتوكول وصف لمتطلبات معينة من الكائنات الحية الدقيقة أي عموما قادرة على تشكيل بيوفيلم. ويبين الشكل 3B القرص الغزل مع 18 أقراص بلاستيكية ملصقة. وخصوصا في هذه الأغشية الحيوية قرص نمت مناسبة تماما للاختبار المضادة للميكروبات وتسفر عن نتائج غاية 11 استنساخه.
الشكل 1. المفاعل تدفق الإعداد بالتنقيط. وصفت عناصر هامة.
الشكل 2. مثال على تدفق بالتنقيط س. بيوفيلم المذهبة. أ) كانت تزرع هذه بيوفيلم لمدة ثلاثة أيام بعد بروتوكول صفها. تتم إزالة الأغطية من الغرفتين الأولى من المفاعل لإظهار S. الصفراء المكورات بيوفيلم الكتلة الحيوية. ب) صورة مجهرية الإلكترون Sacnning من S. بيوفيلم المذهبة التي تزرع في بالتنقيط مفاعل التدفق.
الشكل 3. المفاعل القرص بالتناوب. أ) مثال على القرص الغزل مفاعل قيد التشغيل. وصفت عنصرا رئيسيا. ب) عن قرب عرض قرص الغزل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأغشية الحيوية ونمت في المفاعلات مختلفة في كثير من الأحيان ، والخصائص المختلفة لكل مفاعل لها تطبيقات مختلفة. في هذا العمل ، ونحن تصف استخدام المفاعلات بيوفيلم هما : بيوفيلم تدفق مفاعل بالتنقيط ومفاعل القرص بالتناوب. المفاعلات بالتنقيط تدفق مفيدة لنمو منخفض في الأغشية الحيوية القص واجهة الهواء السائل وقابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من الظروف. نجدهم مريحة للغاية للدراسات حيث كمية كبيرة من الكتلة الحيوية بيوفيلم أمر مرغوب فيه. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذا الإعداد للدراسات التي تنطوي على رصد microsensor واختبار السطوح antibiofilm المحتملة.
المفاعل القرص الدورية مفيد لنمو بيوفيلم متطابقة على أقراص متعددة في إطار بيئة إزالة القص معتدلة. قدرة هذا المفاعل لانتاج الأغشية الحيوية متطابقة متعددة على الأقراص القابلة للإزالة يجعلها مثالية للدراسات التي تنطوي على اختبار المركبات المضادة للميكروبات والسطوح مقاومة بيوفيلم. والعديد من التطبيقات المحتملة عند استخدام هذه المفاعلات بيوفيلم ويتم تشجيع الباحثين على تعديل البروتوكول لأفضل نموذج احتياجاتهم بحثية محددة.
هذه البروتوكولات توفير بدائل للخلية تدفق ثابت والمقايسات الأغشية الحيوية التي استخدمت بشكل مكثف في الماضي. فإنها قد تتيح أيضا مزيدا من القدرة على محاكاة عدوى سريرية متنوعة. ومع ذلك ، هناك قيود محتملة مع كل أسلوب. على سبيل المثال ، مفاعلات بالتنقيط تدفق والمفاعلات القرص الدورية ليست مثالية لتصور الأغشية الحيوية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. أيضا ، فإن فسيولوجيا الأغشية الحيوية تزرع في أنواع مختلفة من المفاعلات تختلف من المرجح بدرجة كبيرة. على سبيل المثال ، فإن المفاعل بالتنقيط تدفق النتيجة في بيوفيلم يتعرض التدرجات الغذائية الشديدة ، التي هي مختلفة تماما عن التدفق الصفحي موحد من وسائل الإعلام عبر تدفق المغذيات بيوفيلم الخلية. في نهاية المطاف ، فإن النوع من المفاعلات المستخدمة تعتمد على بيوفيلم يجري تناول المسائل والمحققين ينبغي أن ندرك أن العديد من أنظمة مفاعل بيوفيلم تتوفر لدراساتهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
NIAID منح K22AI081748.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drip Flow Reactors | BioSurface Technologies Corporation | DFR 110 | |
| Rotating Disk Reactors | BioSurface Technologies Corporation |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. Bacterial biofilms in nature and disease. Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).
- Boles, B. R., Horswill, A. H. Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).
- Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).
- Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system. Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).
- Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. Biofilm resistance to antimicrobial agents. Microbiology. 146, 547-549 (2000).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).
- Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms. J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms. Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).
- Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).
- Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).
Tags
علم المناعة ، العدد 46 ، بيوفيلم ، بالتنقيط تدفق المفاعل ، المفاعل الدورية القرص ، نظام فتح بيوفيلمErratum
Formal Correction: Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011.
Citeable Link.
A correction was made to The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. There was an error with an author's name. The author's middle initial was missing, this was corrected to:
Blaise R. Boles
instead of:
Blaise Boles.
