L'uso del flusso gocciolamento e Reattori disco rotante per Staphylococcus aureus Analisi Biofilm

Summary

Protocolli per l'utilizzo aperto biofilm flusso sistema con reattori a goccia e flusso di rotazione del disco reattori sono presentati in dettaglio.

Abstract

La maggior parte dei microbi in natura si pensa di esistere come superficie associata comunità in biofilm ^1. Biofilm batterici sono racchiusi all'interno di una matrice e collegato a una superficie di ^2. Formazione di biofilm e lo sviluppo sono comunemente studiate in laboratorio utilizzando sistemi batch come micropiastre o di flusso sistemi, come il flusso delle cellule. Queste metodologie sono utili per lo screening di librerie di mutanti e chimiche (micropiastre) ³ o crescente biofilm per la visualizzazione (celle di flusso) ^4. Qui vi presentiamo protocolli dettagliati per Staphylococcus aureus in crescita in due ulteriori tipi di biofilm sistema di flusso: il flusso del reattore a goccia biofilm e la rotazione del reattore biofilm disco.

Drip reattori biofilm flusso sono progettati per lo studio dei biofilm cresciuto in condizioni di taglio basso. ⁵ Il reattore di flusso a goccia si compone di quattro canali di test in parallelo, ciascuno in grado di tenere uno standard microscopio cedola di vetro di dimensioni diapositiva o una lunghezza del catetere o stint. Il reattore di flusso a goccia è ideale per il monitoraggio microsensor, generale studi biofilm, i campioni di biofilm criosezionamento, la produzione di biomassa ad alta, valutazioni materiale medico, e dimora test del dispositivo medico. ^6,7,8,9

Il reattore disco rotante è costituito da un disco di teflon che contiene recessi per cedole rimovibile. ¹⁰ Il coupon staccabile può in fatto di qualsiasi materiale lavorabile. La parte inferiore del disco rotante contiene una barra magnetica per consentire la rotazione del disco di creare taglio liquido sulla superficie-superficie a filo coupon. L'intero disco contenente 18 tagliandi è posto in un recipiente di vetro 1000 ml reattore braccio laterale. Un supporto crescita liquido viene fatto circolare attraverso la nave mentre il disco viene ruotato da un agitatore magnetico. Le cedole vengono rimossi dal contenitore del reattore e poi raschiato per raccogliere il campione biofilm per ulteriori studi o immagini di microscopia. Reattori disco rotante sono progettate per le valutazioni di laboratorio di efficacia biocida, rimozione biofilm, e le prestazioni di anti-fouling dei materiali. ^9,11,12,13

Protocol

1. La goccia di flusso reattore Biofilm

1. Il flusso del reattore a goccia biofilm (disponibile da Technologies Biosurface o versioni progettate su misura di solito può essere fatta da officine meccaniche università, vedi figura 1) è assemblato e autoclave. Assemblea coinvolge coupon apposizione in camere e coperchi della camera di fissaggio. La camera, insieme con il mezzo biofilm (brodo di soia trittico 2 grammi / L di glucosio e 2 grammi / L) e influente tubi nutrienti sono sterilizzati in autoclave.
2. Inoculazione del reattore flusso goccia è preformato posizionando il reattore su una superficie piana, le linee di serraggio tubi effluenti, riempiendo ogni camera con 10 ml di brodo di soia trittico e l'aggiunta di 10 L di una S. cultura aureus cresciute overnight in brodo di soia trittico. Il reattore viene inoculato svolge in un incubatore a 37 ° C per 18 ore.
3. Dopo 18 ore di incubazione, il tubo emissario è unclamped e il reattore è posto su un blocco di legno tagliato ad un angolo di 10 °.
4. Asetticamente collegare il tubo influente nutriente per la bottiglia contenente il brodo di coltura in continuo flusso. Alimentare la linea di tubazione attraverso la pompa e il primo dei tubi eseguendo la pompa ad una velocità massima (varia a seconda del modello della pompa).
5. Una volta che il tubo influente è innescato fermare la pompa e collegare collegare aghi (22 gauge e da 1 pollice) alla fine di ogni provetta. Pulire il tappo di ingresso camera con etanolo pulire in modo asettico e inserire gli aghi attraverso il tappo di aspirazione.
6. Accendere la pompa e lasciare i media a sgocciolare lentamente (portata ~ 125 microlitri / minuto) sui coupon. I media dovrebbero flusso verso il basso lungo la cedola dal porto tappo di ingresso al porto effluenti. Far funzionare il reattore in flusso continuo per 2-5 giorni (a seconda dell'applicazione), controllando di tanto in tanto il reattore per il drenaggio adeguato.
7. Per raccogliere il flusso di biofilm reattore a goccia, fermare la pompa e rimuovere con attenzione gli aghi dal reattore. Il reattore può essere collocato su una superficie piana ed i tagliandi possono essere rimosse in modo asettico con pinza sterile. Se microscopia è desiderato, i tagliandi possono essere trattati di conseguenza (Figura 2B è un microscopio elettronico a scansione di un biofilm S. aureus cresciuto in un reattore a biofilm goccia a goccia). Se la quantificazione della biomassa biofilm o studi fisiologia sono l'obiettivo dello studio, il biofilm può essere rimosso dalla cedola con un raschietto cellulare. Tenendo il coupon con una pinza, raschiare delicatamente il biofilm fuori il buono in una provetta conica contenente tampone fosfato con un raschietto cellulare. Nota: per quantificare l'unità formanti colonia nel biofilm, è necessario omogeneizzare il biofilm raccolte con un tessuto omogeneizzatore di disaggregare grumi e formare una sospensione omogenea. Diversi modelli di omogeneizzatori tessuto sono adatti per questa applicazione. Utilizziamo un Fisher Scientific Tissuemiser Omogeneizzatore (prodotto # 15-338-420) alla massima velocità per 1 minuto per omogeneizzare campioni di biofilm. Il mancato omogeneizzare il biofilm si tradurrà in una sottostima delle unità formanti colonie presenti nel campione.

2. La rotazione del disco reattore Biofilm

1. La rotazione del reattore biofilm disco (disponibile da disponibile da Technologies Biosurface o possono essere realizzati su misura, vedi figura 3) è assemblato e autoclave. Montare il reattore dal primo posto il disco rotante tagliandi nelle fessure del disco filatura e inserirlo in una da 1 litro bicchiere di vetro di una porta di overflow. Un numero 15-tappo di gomma con fori in esso per consentire il flusso dei media e aerazione è usato come il tappo del reattore. Il reattore, biofilm media (brodo di soia trittico 2 g / L di glucosio e 2 g / L) e quello in ingresso sono poi sterilizzati in autoclave.
2. La rotazione del reattore biofilm disco viene inoculato mettendo 250 ml di medium sterile all'interno del reattore, e l'aggiunta di 0,5 ml di una notte di S. cultura aureus coltivato in brodo di soia trittico. Il reattore è quindi posto su un piatto mescolate insieme a 250 giri al minuto e incubato per una notte alla temperatura desiderata.
3. Dopo 16 ore di incubazione collegare il tubo di ingresso alla porta sul serbatoio medio e collegarlo alla pompa peristaltica. La pompa è quindi accendere e il flusso impostato ~ 0,25 ml / min (flusso può essere modificato a seconda del tasso di crescita desiderato).
4. Dopo 24 ore fermare il reattore e asetticamente rimuovere il disco senza toccare i tagliandi biofilm. Rimuovere i tagliandi con pinza sterile e immergere ognuno in tampone fosfato di rimuovere i batteri debolmente collegato.
5. Per il test composto antimicrobico, i chip possono essere inseriti in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti composti di interesse. Dopo l'incubazione, i chip vengono trasferiti in tubi da 1,5 ml microcentrifuga contenente 1 ml di soluzione salina tampone fosfato e omogeneizzati con un fazzoletto omogeneizzatore per disperdere il biofilm intatto.
6. Le cellule sono poi diluiti seriale e placcato su terreno di agar nutriente per determinare microbismo Formiunità ng.
7. Nota: molte varianti possono essere effettuate sul protocollo di cui sopra. Per esempio, buoni disco rotante può essere rivestito con o fatti di potenziale anti-biofilm composti per testare l'efficacia. Disperdenti biofilm possono essere valutati anche in incubazione tagliandi in composti disperdente e quantificazione dei batteri attaccati contro distaccato.

3. Rappresentante Risultati

Un esempio di un set up reattore a goccia flusso viene visualizzato se Figura 1. Dopo tre giorni di flusso abbondante biofilm si accumulano sulla superficie della cedola, figura 2A. La biomassa totale varia a seconda ceppi batterici e condizioni di crescita precisa. Un microscopio elettronico a scansione di un S. biofilm aureus cresciuto nel reattore flusso goccia è mostrato nella Figura 2B.

Un reattore disco rotante è mostrato in figura 3A. Il protocollo descritto può essere adattato alle specifiche esigenze di generale qualsiasi microrganismo in grado di formare un biofilm. Figura 3B mostra il disco rotante con 18 dischi di plastica apposta. Questi disco-grown biofilm sono particolarmente adatti per i test antimicrobici e portare a risultati altamente riproducibili ^11.

Figura 1. Il flusso di setup a goccia reattore. Componenti importanti sono etichettati.

Figura 2. Esempio di un flusso goccia S. aureus biofilm. A) Il biofilm è stato coltivato per tre giorni, seguendo il protocollo descritto. Coperchi dai primi due camere del reattore vengono rimossi per mostrare il giallo S. aureus biofilm biomassa. B) Sacnning microscopio elettronico di una S. biofilm aureus cresciuto nel reattore flusso gocciolamento.

Figura 3. Il reattore disco rotante. A) Esempio di funzionamento di un reattore disco rotante. Componente chiave sono etichettati. B) Primo piano vista di un disco rotante.

Discussion

Biofilm cresciuto nei reattori differenti spesso hanno caratteristiche diverse e ogni reattore ha applicazioni diverse. In questo lavoro, si descrive l'uso di due reattori biofilm: un flusso reattore a goccia biofilm e un reattore disco rotante. Drip reattori di flusso sono utili per la coltivazione a basso biofilm taglio in un aria-liquido e sono adattabili ad una varietà di condizioni. Li troviamo estremamente conveniente per gli studi in cui una grande quantità di biomassa biofilm è auspicabile. Questa configurazione può essere facilmente adattato per gli studi che coinvolgono microsensor monitoraggio e la verifica delle superfici antibiofilm potenziale.

Il reattore disco rotante è utile per la crescita di biofilm identici su più dischi rimuovere in un ambiente moderato taglio. La capacità di questo reattore per la produzione di biofilm multipli identici su dischi rimovibili lo rende ideale per gli studi sulla sperimentazione di composti antimicrobici e superfici resistenti biofilm. Molte applicazioni sono possibili quando si utilizzano questi reattori biofilm e ricercatori sono invitati a modificare il protocollo di modello migliore le loro esigenze di ricerca specifici.

Questi protocolli prevedono alternative alla cella a flusso e statica biofilm saggi che sono stati utilizzati più ampiamente in passato. Essi possono anche fornire una maggiore capacità di simulare diverse infezioni cliniche. Tuttavia, ci sono limitazioni potenziali con ogni tecnica. Per esempio, la flebo-flow reattori e reattori disco rotante non sono l'ideale per la visualizzazione di biofilm mediante microscopia confocale. Inoltre, la fisiologia del biofilm coltivate in diversi tipi di reattore sarà probabilmente molto diversi. Per esempio, la flebo-flow reattore si tradurrà in un biofilm essere esposto gravi pendenze nutriente, che è molto diverso dal flusso laminare uniforme di terreni di coltura in una cella di flusso biofilm. In ultima analisi, il tipo di reattore biofilm utilizzati dipenderà sulle questioni affrontate e gli investigatori devono essere consapevoli che molteplici sistemi di reattori biofilm sono disponibili per i loro studi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drip Flow Reactors	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
Rotating Disk Reactors	BioSurface Technologies Corporation