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Immunology and Infection

에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 Biofilm 분석

Published: December 27, 2010 doi: 10.3791/2470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan

ERRATUM NOTICE

Summary

드립 흐름 반응기로 개방형 시스템 흐름 biofilms을 활용하여 디스크 원자로 회전을위한 프로토콜이 상세하게 제공됩니다.

Abstract

자연의 대부분의 미생물이 1 세균성 biofilms는 매트릭스 안에 쌌다 있습니다. biofilms의 표면 관련된 커뮤니티와 같은 존재로 생각하고 표면 2. Biofilm 형성과 발전에 연결된하는 것은 일반적으로 이러한 microtiter 접시 또는 흐름으로 배치 시스템을 사용하여 실험실에서 연구 아르 이러한 흐름 - 세포와 같은 시스템. 이러한 방법은 돌연변이와 화학 라이브러리 (microtiter 접시) 시각화 (유동 세포) 4 3 또는 성장 biofilms를 검사하는 데 유용합니다. 드립 흐름 biofilm 반응기와 회전 디스크 biofilm 반응기 : 여기 우리는 흐름 시스템 biofilms 두 가지 추가적인 유형의 성장 포도상 구균에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

드립 흐름 biofilm 원자로는 낮은 전단 조건 하에서 재배 biofilms의 연구를 위해 설계되었습니다. 5 드립 흐름 반응기 네 가지 병렬 테스트 채널 하나의 표준 유리 현미경 슬라이드 크기의 쿠폰을 가지고 각각의 능력, 또는 카테 테르 또는 정량의 길이로 구성되어 있습니다. 드립 흐름 반응기 microsensor 모니터링, 일반 biofilm 연구, biofilm cryosectioning 샘플, 높은 바이오 매스 생산, 의료 재료 평가하고, 내재하는 의료 기기 테스트에 이상적입니다. 6,7,8,9가

회전 디스크 반응기 이동식 쿠폰에 대한 recesses를 포함하는 독보적인 디스크로 구성되어 있습니다. 10 이동식 쿠폰 어떠한 machinable 재료로 만든 수 있습니다. 회전 디스크의 아래쪽의 디스크 회전이 표면 플러시 쿠폰 걸쳐 액체 표면 전단을 만들 수 있도록하는 막대 자석이 포함되어 있습니다. 18 쿠폰을 포함하여 전체 디스크는 1000 ML 유리 사이드 암 원자로 용기에 배치됩니다. 디스크가 자기 활동가에 의해 회전하는 동안 액체 성장 미디어는 혈관을 통해 순환됩니다. 쿠폰은 원자로 용기에서 제거 후 진학이나 현미경 이미징을위한 biofilm 샘플을 수집하는 스크랩한 있습니다. 회전 디스크 원자로는 biocide의 효능, biofilm 제거 및 방지 오염 물질의 성능 실험실 평가를 위해 설계되었습니다. 9,11,12,13

Protocol

1. 드립 흐름 Biofilm 반응기

  1. 드립 흐름 biofilm 반응기가 조립 autoclaved입니다 (Biosurface 기술 또는 사용자 정의 디자인 버전에서 사용할 수 일반적으로 대학의 기계 상점으로 만들 수 있습니다, 그림 1 참조). 조립 실 및 확보 챔버 뚜껑에 affixing 쿠폰을 포함한다. biofilm 매체 (tryptic 간장 국물 2g / L과 포도당 2g / L) 및 유입 영양 튜브와 함께 챔버는 autoclaving 소독을하고 있습니다.
  2. 드립 흐름 반응기의 접종은 평평한 표면에 반응기를 삽입 유출 튜브 라인을 클램핑, 10 ML tryptic 간장 국물과 함께 각각의 챔버를 작성하고 S. 10 μL를 추가하여 preformed입니다 구균 문화는 tryptic 간장 국물에 하룻밤 성장. 주사 원자로 그때가 18 시간 동안 37 ° C 배양기에서 개최됩니다.
  3. 배양 18 시간 후, 유출 튜브는 unclamped되고 반응은 10 ° 각도로 절단 나무 블록에 위치합니다.
  4. 무균 지속적인 흐름 영양의 국물이 들어있는 병에 유입 영양 튜브를 연결합니다. 최대 속도 (펌프 모델에 따라 달라질 수 있습니다)에서 펌프를 실행하여 펌프 및 주요 튜브를 통해 튜브 라인 피드.
  5. 일단 유입 튜브는 펌프를 중지하고 각 튜브의 끝 부분에 연결 바늘 (22 게이지 1 인치)를 첨부하여 준비하는 것입니다. 에탄올 닦아 및 무균 입구 마개를 통해 바늘을 삽입과 챔버 입구 마개를 닦아주십시오.
  6. 펌프의 전원을 켜고 쿠폰 이상 (유량 ~ 125 μL / 분) 미디어가 천천히 똑 수 있습니다. 미디어 입구 마개 포트에서 유출 포트에 쿠폰을 따라 아래로 흐름을해야합니다. 때때로 적절한 배수에 대한 반응을 확인, 2-5일 (응용 프로그램에 따라 다름)에 대한 지속적인 흐름에서 원자로를 운영하고 있습니다.
  7. 드립 흐름 반응기 biofilms를 수확하기 위해 펌프를 중지하고 신중하게 반응에서 바늘을 제거하십시오. 반응은 다음 평평한 표면에 배치 수 있으며 쿠폰은 무균 살균 집게를 사용하여 제거할 수 있습니다. 현미경을 원하는 경우, 쿠폰 이제 적절하게 처리할 수 있습니다 (그림 2B는 드립의 biofilm 반응기 재배 S. 구균의 biofilm의 스캐닝 전자 현미경입니다.) biofilm의 바이오 매스 혹은 생리학 연구 부량이 연구의 목적 경우, biofilm은 세포 스크레이퍼를 사용하여 쿠폰에서 제거할 수 있습니다. 포셉과 쿠폰을 들고 있지만, 부드럽게 인산염을 포함하는 원뿔 관에 쿠폰 해제 biofilm을 다쳤고,이 세포 스크레이퍼를 사용하여 염분 버퍼. 참고 : biofilms의 단위를 형성 식민지를 정할, 그것이 대단히 짧은 시간을 disaggregate하고 동질적인 정지를 형성 균 질기 조직으로 수확 biofilms를 균질 필요합니다. 조직 homogenizers 다양한 모델이 응용 프로그램에 적합합니다. 우리는 biofilm 샘플을 균질 1 분간 최대 속도 피셔 사이 언티픽 Tissuemiser 균 질기를 (제품 # 15-338-420) 활용. biofilm을 균질하지 않으면 예제에있는 단위를 형성 식민지의 싼 견적가 발생합니다.

2. 회전 디스크 Biofilm 반응기

  1. 회전 디스크 biofilm 반응기는 (만들어, 그림 3을 참조하십시오 Biosurface 기술에서 사용할 수에서 제공 또는 사용자 정의 가능) 조립 autoclaved입니다. 처음으로 원자로를 조립 회전 디스크의 슬롯에 디스크 쿠폰을 회전하고 오버플로 포트와 1 리터 유리 비커에 넣어. 미디어 흐름과 통기를 허용하도록 거기에 뚫고 구멍 번호 15 고무 마개는 원자로의 뚜껑으로 사용됩니다. 반응기, biofilm 미디어 (tryptic 간장 국물 2가 G / L과 포도당 2g / L) 및 유입 관은 다음 autoclaving 소독을하고 있습니다.
  2. 회전 디스크 biofilm 반응기는 반응기로 멸균 매체 250 MLS를 배치하여 주사하고, 밤새 S. 0.5 ML를 추가합니다 구균 문화는 tryptic 간장 국물 재배. 반응은 다음 RPM을 250으로 설정 저어 접시에 위치하고 원하는 온도에서 하룻밤 incubated입니다.
  3. 배양 16 시간 중간 저수지에있는 포트에 유입 튜브를 연결하고 연동 펌프에 연결 후. 펌프는 다음을 설정하고 흐름 ~ 0.25 ML / 분 (흐름이 원하는 성장 속도에 따라 변경될 수 있음)으로 설정합니다.
  4. 24 시간 후에 반응을 중단하고 무균 biofilm 쿠폰을 건드리지 않고도 디스크를 제거합니다. 멸균 집게를 사용하여 쿠폰을 제거하고 인산으로 각각의 하나를 찍어은 느슨하게 연결된 박테리아를 제거하는 살린 버퍼.
  5. 항균 화합물 테스트, 칩의는 관심의 화합물을 포함하는 96 잘 접시의 각각의 우물에 삽입할 수 있습니다. 부화 후, 과자는 1 ML 인산 버퍼 호수를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송되며 그대로 biofilm을 해산하기 위해 균 질기 휴지로 균질.
  6. 전지는 다음 직렬 희석하여 가능한 식민지 formi을 결정하는 영양 한천 배지에 비쳐지게 만들려합니다NG 단위.
  7. 참고 : 많은 변화가 위의 프로토콜에 만들 수 있습니다. 예를 들어, 회전 디스크 쿠폰과 코팅 수있는이나 효능을 테스트하기 위해 잠재적인 안티 biofilm 화합물로 만들어. Biofilm의 dispersants 또한 분산제 화합물과 연결된 대 분리 quantifying 박테리아에 쿠폰을 잠복기 수 평가할 수 있습니다.

3. 대표 결과

드립 흐름 반응기까지 일련의 예제는 그림 1하면 표시됩니다. 흐름 3 일 후에 biofilm의 풍부한 금액은 쿠폰 표면, 그림 2A에 축적됩니다. 총 바이오 매스는 박테리아 변종과 정확한 성장 조건에 따라 달라집니다. S.의 검색 전자 현미경 드립 흐름 반응기에서 재배 구균의 biofilm은 그림 2B에 표시됩니다.

회전 디스크 반응기는 그림 3A에 표시됩니다. 설명 프로토콜은 biofilm을 형성 능력이 일반적으로 어떤 미생물의 특정 요구 사항을 적용할 수 있습니다. 그림 3B 18 플라스틱 디스크 부착된와 함께 회전하는 디스크를 보여줍니다. 이러한 디스크 성장 biofilms은 특히 항균 테스트에 적합하고 높은 재현성 결과가 11을 얻을 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 드립 흐름 반응기 설정. 중요 구성 요소가 표시됩니다.

그림 2
그림 2. 드립 흐름의 예 S. 구균의 biofilm. A)이 biofilm은 설명된 프로토콜을 다음 세 가지 일 동안 성장했다. 반응기의 처음 두 챔버의 뚜껑은 노란색 S. 보여주 제거 구균의 biofilm의 바이오 매스. S.의 B) Sacnning 전자 현미경 구균의 biofilm은 똑 흐름 반응기에서 재배.

그림 3
그림 3. 회전 디스크 반응기. 실행중인 회전 디스크 원자로의) 예. 주요 구성 요소가 표시됩니다. B) 회전 디스크의보기를 닫습니다.

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Discussion

다른 원자로 재배 Biofilms는 종종 서로 다른 특성을 것입니다 각 반응기의 다른 응용 프로그램이 있습니다. 드립 흐름 biofilm 반응기와 회전 디스크 반응 :이 작품에서 우리는 두 biofilm 원자로의 사용을 설명합니다. 드립 흐름 원자로 공기 - 액체 인터페이스 낮은 전단 biofilms 성장을위한 유용하고 다양한 상황에 적용할 수 있습니다. 우리는 biofilm의 바이오 매스의 대량이 바람직 연구들이 매우 편리하게 찾아보세요. 이 설정은 쉽게 microsensor 감시하고 잠재적인 antibiofilm 표면의 테스트를 포함 공부를 적용할 수 있습니다.

회전 디스크 반응기 중간 전단 환경에서 제거하는 디스크에서 여러 동일한 biofilm 성장하는 데 유용합니다. 이동식 디스크에 여러 개의 동일한 biofilms를 생산하는이 원자로의 능력 항균 화합물 및 biofilm 모성 표면의 테스트를 포함 연구에 적합합니다. 이러한 biofilm의 원자로를 사용하고 연구자가 최고의 모델을 자신의 구체적인 조사 요구를 프로토콜을 수정하는 것이 좋습니다 때 많은 응용이 가능합니다.

이러한 프로토콜은 흐름 세포와 과거에 더 광범위하게 사용되었습니다 정적 assays의 biofilms에 대한 대안을 제공합니다. 그들은 또한 다양한 임상 감염을 모방하기 위해 더 큰 능력을 제공할 수 있습니다. 그러나, 각각의 기술과 잠재력 한계가 있습니다. 예를 들어, 똑 흐름 반응기 및 회전 디스크 원자로 공촛점 현미경으로 biofilms를 시각화에 이상적되지 않습니다. 또한, 원자로의 종류 재배 biofilms의 생리 가능성이 크게 달라집니다. 예를 들어, 똑 흐름 반응기는 흐름 전지 biofilm를 통해 영양소를 미디어의 균일한 층류에서 매우 다른 심각한 영양 그라디언트 노출되는 biofilm에 발생합니다. 궁극적으로, 활용 biofilm 반응기의 종류는 질문에 해결되는에 의존하고 수사는 여러 biofilm 반응기 시스템들이 연구에 사용할 수있는 것을 알아야합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

NIAID 부여 K22AI081748.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drip Flow Reactors BioSurface Technologies Corporation DFR 110
Rotating Disk Reactors BioSurface Technologies Corporation

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References

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Tags

면역학 제 46 biofilm 똑 흐름 반응기 반응기 회전 디스크 개방형 시스템 biofilm

Erratum

Formal Correction: Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. There was an error with an author's name. The author's middle initial was missing, this was corrected to:

Blaise R. Boles

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Blaise Boles.

에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용<em> 포도상 구균</em> Biofilm 분석
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Cite this Article

Schwartz, K., Stephenson, R.,… More

Schwartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. J. Vis. Exp. (46), e2470, doi:10.3791/2470 (2010).

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