ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
הפרוטוקולים של ניצול לפתוח זרימת biofilms מערכת עם כורים זרימה טפטוף וסיבוב כורים דיסק מוצגים בפירוט.
Abstract
רוב החיידקים בטבע נחשבים להתקיים משטח הקשורים הקהילות biofilms. Biofilms 1 חיידקית נארזים בתוך מטריצה ומצורפת היווצרות של 2 פני. Biofilm ופיתוח נלמדים בדרך כלל במעבדה באמצעות מערכות אצווה כגון צלחות microtiter או זרימה מערכות, כגון תאים הזרימה. מתודולוגיות אלה שימושיים להקרנה ספריות מוטציה כימיים (צלחות microtiter) 3 או גדל biofilms להדמיה (תאים זרימה) 4. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים סטפילוקוקוס גדל בשני סוגים נוספים של biofilms מערכת זרימה: זרימת לטפטף הכור biofilm ו biofilm המסתובב הכור דיסק.
תזרים בטפטוף כורים biofilm מיועדים ללימוד biofilms גדל בתנאים גזירה נמוך. 5 הכור זרם טפטוף מורכבת מארבעה ערוצי בדיקה במקביל, כל אחד מסוגל להחזיק כוס אחת רגילה מיקרוסקופ שקופיות בגודל קופון, או אורך של קטטר או תפקיד. הכור זרם טפטוף אידיאלית עבור ניטור microsensor, כללי מחקרים biofilm, דגימות biofilm cryosectioning, ייצור ביומסה גבוהה, הערכות חומר רפואי, בדיקות שכינת המכשור הרפואי. 6,7,8,9
הכור דיסק מסתובב כולל דיסק המכיל טפלון נבכי קופונים נשלף. 10 קופונים נשלף ניתן על ידי מכל חומר machinable. התחתון של הדיסק מסתובב מכיל מגנט לבר כדי לאפשר סיבוב הדיסק כדי ליצור גזירה פני הנוזל על פני השטח, סומק קופונים. דיסק שלם המכיל 18 קופונים ממוקם ספינת 1000 מ"ל בצד זרוע זכוכית הכור. התקשורת גידול נוזלי מופץ באמצעות כלי ואילו הדיסק הוא הסתובב על ידי stirrer מגנטי. קופונים מוסרים כלי הכור ואז מגורד לאסוף את דגימת biofilm למחקר נוסף או הדמיה במיקרוסקופ. כורים דיסק סיבוב מיועדים הערכות מעבדה יעילות biocide, הסרת biofilm, ואת הביצועים של חומרים אנטי עכירות. 9,11,12,13
Protocol
1. תזרים בטפטוף biofilm Reactor
- זרם טפטוף biofilm הכור (זמין טכנולוגיות Biosurface או גרסאות מותאמות אישית נועד בדרך כלל ניתן על ידי החנויות אוניברסיטה מכונה, ראה תרשים 1) היא התאספו autoclaved. העצרת כוללת קופונים הדבקת בתאי ומכסים קאמרית האבטחה. החדר, יחד עם biofilm בינוני (מרק סויה tryptic 2 גרם / ליטר ו - 2 גרם גלוקוז / L), ואת צינורות ההזנה influent הם מעוקרים ידי מעוקר.
- הרכבה של הכור זרם טפטוף הוא preformed ידי הצבת את הכור על משטח שטוח, מהדק את קווי צינורות שפכים, מילוי כל תא עם מרק סויה 10 מ"ל tryptic והוספת 10 μL של ס תרבות aureus גדל בן לילה במרק סויה tryptic. הכור הוא מחוסן אז מקום 37 ° C בחממה במשך 18 שעות.
- לאחר 18 שעות של דגירה, צינורות השפכים הוא unclamped ואת הכור ממוקם על בלוק עץ לחתוך בזווית של ° 10.
- בסביבה נקייה מחיידקים, לחבר את צינורות ההזנה influent לבקבוק המכיל את מרק מזין זרימה רציפה. להאכיל את קו צינורות דרך המשאבה לבין הממשלה את הצינורות על ידי הפעלת המשאבה במהירות המקסימלית (משתנה בהתאם לדגם משאבה).
- לאחר בצינור influent ערוכה לעצור את המשאבה ואת לצרף מחטים להתחבר (22 מד, 1 אינץ') לסוף כל צינור. נגבו את פקק היניקה קאמרית עם אתנול לנגב בסביבה נקייה מחיידקים, להכניס את המחטים באמצעות פקק היניקה.
- הפעל את המשאבה ולאפשר התקשורת כדי לטפטף לאט (קצב זרימה ~ 125 μL / דקה) על קופונים. התקשורת צריכה לזרום כלפי מטה לאורך הקופון מנמל פקק כניסת ליציאת השפכים. הפעילו את הכור זרימה רציפה של 2-5 ימים (בהתאם ליישום), מדי פעם לבדוק את הכור לניקוז תקין.
- כדי לקצור את זרם טפטוף biofilms הכור, להפסיק את המשאבה בזהירות להסיר את המחטים מהכור. הכור אז יכול להיות מונח על משטח שטוח את הקופונים ניתן להסיר בסביבה נקייה מחיידקים באמצעות מלקחיים סטרילית. אם במיקרוסקופ הוא הרצוי, את הקופונים יכולים כעת להיות מעובד בהתאם (תרשים 2B הוא מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של biofilm S. aureus גדל כור biofilm טפטוף). אם כימות של ביומסה biofilm או לימודי הפיזיולוגיה הם מטרת המחקר, biofilm ניתן להסיר את הקופון באמצעות מגרד התא. בעוד מחזיק את הקופונים עם מלקחיים, בעדינות לגרד את biofilm את הקופון לתוך צינור חרוטי המכיל פוספט שנאגרו מלוחים באמצעות מגרד התא. הערה: לכמת את המושבה להרכיב יחידות biofilms, יש צורך homogenize biofilms שנקטפו עם רקמות homogenizer כדי disaggregate גושים ויוצרים ההשעיה הומוגנית. מודלים שונים של רקמות homogenizers מתאימים עבור יישום זה. אנו מנצלים מדעי פישר Tissuemiser Homogenizer (מוצר # 15-338-420) במלוא המהירות לרגע 1 עד homogenize דגימות biofilm. אי homogenize biofilm תגרום הערכה נמוכה מדי של המושבה הקמת יחידות להציג במדגם.
2. Biofilm סיבוב הדיסק Reactor
- Biofilm מסתובב הדיסק הכור (זמין זמין טכנולוגיות Biosurface או יכול להיות מותאם אישית עשה, ראה איור 3) היא התאספו autoclaved. להרכיב את הכור על ידי המקום הראשון ספינינג קופונים דיסק לתוך החריצים של הדיסק ספינינג הצבת אותו לתוך כוס 1 ליטר זכוכית עם יציאת בגלישה. מספר 15-פקק גומי עם חורים שנקדחו בו כדי לאפשר זרימת מדיה אוורור משמש מכסה את הכור. הכור, biofilm מדיה (מרק סויה tryptic 2 g / L של הגלוקוז 2 g / L), צינורות היניקה הם מעוקרים לאחר מכן על ידי מעוקר.
- Biofilm מסתובב הכור הדיסק הוא מחוסן ידי הצבת 250 MLS של המדיום סטרילי לתוך הכור, ומוסיף 0.5 מ"ל של ס 'לילה תרבות aureus גדל מרק סויה tryptic. הכור ממוקם אז בצלחת ומערבבים מוגדר 250 סל"ד ו מודגרות לילה בטמפרטורה הרצויה.
- לאחר 16 שעות של דגירה לחבר את צינור היניקה לנמל על מאגר בינוני ולחבר אותו המשאבה peristaltic. המשאבה ואז להפעיל זרם מוגדר ~ 0.25 mL / min (תזרים ניתן לשנות בהתאם לקצב הצמיחה הרצוי).
- לאחר 24 שעות לעצור את הכור בסביבה נקייה מחיידקים, להסיר את הדיסק בלי לגעת קופונים biofilm. הסר את הקופונים באמצעות מלקחיים סטרילית לטבול כל אחד לתוך פוספט שנאגרו מלוחים כדי להסיר כל חיידקים המצורפת רופף.
- עבור בדיקות מתחם מיקרוביאלית, שבבי ניתן להציב לתוך בארות בודדים של צלחת 96 באר המכילים תרכובות של עניין. לאחר דגירה, שבבי מועברים לתוך 1.5 microcentrifuge צינורות מ"ל המכילה 1 מ"ל תמיסת מלח פוספט חיץ הומוגני עם רקמות homogenizer לפזר את biofilm ללא פגע.
- תאים הם מדולל אז סדרתי מצופה על מדיום אגר מזין לקבוע המושבה formi קיימאng יחידות.
- הערה: וריאציות רבות יכול להתבצע על פרוטוקול לעיל. לדוגמה, קופונים דיסק מסתובב יכולים להיות מצופים או עשויים אנטי biofilm תרכובות פוטנציאל מבחן היעילות. Dispersants biofilm ניתן גם להעריך להיות דוגרים קופונים תרכובות dispersant וחיידקים לכימות מצורף לעומת מנותקת.
3. נציג תוצאות
דוגמה להגדיר את הכור זרם טפטוף תוצג אם באיור 1. אחרי שלושה ימים של זרימת כמויות עצומות של biofilm יצטברו על פני השטח קופון, איור 2A. ביומסה סה"כ ישתנו בהתאם זני חיידקים ותנאי צמיחה מדויקת. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של ס biofilm aureus גדל הכור זרם טפטוף מוצג תרשים 2B.
הכור דיסק מסתובב מוצגת דמות 3A. הפרוטוקול המתואר ניתן להתאים את הדרישות הספציפיות של כל מיקרואורגניזם בדרך כלל מסוגל להרכיב biofilm. איור 3 ב מציג את הדיסק מסתובב עם 18 דיסקיות פלסטיק מודבקת. דיסק גדל biofilms אלה הם במיוחד גם מתאים בדיקות מיקרוביאלית ו להניב תוצאות לשעתקו מאוד 11.
באיור 1. הזרימה לטפטף ההתקנה הכור. מרכיבים חשובים מסומנים.
איור 2. דוגמה זרימה טפטוף ס aureus biofilm. א) biofilm זה היה גדל במשך שלושה ימים בעקבות פרוטוקול המתואר. מכסים משני החדרים הראשונים של הכור יוסרו להראות ש צהוב biofilm aureus ביומסה. ב) Sacnning מיקרוסקופ אלקטרונים של ס biofilm aureus גדל הכור זרם טפטוף.
איור 3. הכור דיסק מסתובב. א) דוגמה של הכור מפעיל דיסק מסתובב. מרכיב מפתח מסומנים. ב) תקריב לאור דיסק מסתובב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biofilms גדל כורים שונה לעיתים קרובות יש מאפיינים שונים הכור לכל יישומים שונים. בעבודה זו אנו מתארים את השימוש של שני כורים biofilm: זרימה טפטוף biofilm הכור כור דיסק מסתובב. בטפטוף כורים תזרים שימושיים גדל biofilms גזירה נמוך בממשק אוויר נוזלי והם להתאמה למגוון רחב של מצבים. אנחנו מוצאים אותם מאוד נוח ללימודי שבו כמות גדולה של ביומסה biofilm רצוי. התקנה זו יכול בקלות להיות מותאמים עבור מחקרים שכללו מעקב microsensor ואת בדיקות משטחי antibiofilm פוטנציאליים.
הכור דיסק מסתובב שימושי גדל biofilm זהים מרובים בדיסקים להסיר תחת סביבת גזירה מתונים. היכולת של הכור הזה כדי לייצר biofilms זהים מרובים על דיסקים נשלפים הופך אותו לאידיאלי עבור מחקרים שכללו בדיקות של תרכובות מיקרוביאלית עמידים משטחים biofilm. יישומים רבים אפשריים בעת שימוש אלה כורים biofilm וחוקרים מוזמנים לשנות את פרוטוקול המודל הטוב ביותר לצרכים הספציפיים שלהם במחקר.
פרוטוקולים אלה מספקים אלטרנטיבות התא זרימה סטטי מבחני biofilms שהיו בשימוש נרחב יותר בעבר. הם עשויים גם לספק יכולת גדולה יותר לחקות זיהומים קליניים שונים. עם זאת, ישנן מגבלות פוטנציאליות עם טכניקה זו. לדוגמה, לטפטף זרימה כורים וכורים דיסק מסתובב אינם אידיאליים עבור חזותי biofilms ידי מיקרוסקופיה confocal. כמו כן, הפיזיולוגיה של biofilms מגדלים סוגים שונים של כורים צפוי להשתנות באופן משמעותי. כך, למשל, את הכור לטפטף זרימה תגרום biofilm נחשפים הדרגתיים תזונתי חמור, שהוא שונה מאוד מן הזרימה למינרית אחידה של התקשורת מזין ברחבי biofilm תא הזרימה. בסופו של דבר, סוג של כור biofilm מנוצל יהיה תלוי בשאלות שפונים והחוקרים צריכים להיות מודעים לכך מרובות הכור מערכות biofilm זמינים עבור לימודיהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
NIAID מענק K22AI081748.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drip Flow Reactors | BioSurface Technologies Corporation | DFR 110 | |
| Rotating Disk Reactors | BioSurface Technologies Corporation |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. Bacterial biofilms in nature and disease. Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).
- Boles, B. R., Horswill, A. H. Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).
- Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).
- Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system. Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).
- Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. Biofilm resistance to antimicrobial agents. Microbiology. 146, 547-549 (2000).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).
- Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms. J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms. Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).
- Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).
- Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).
Tags
אימונולוגיה גיליון 46 biofilm הזרימה כור לטפטף הכור דיסק מסתובב biofilm מערכת פתוחהErratum
Formal Correction: Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011.
Citeable Link.
A correction was made to The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. There was an error with an author's name. The author's middle initial was missing, this was corrected to:
Blaise R. Boles
instead of:
Blaise Boles.
