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Immunology and Infection

ड्रिप फ्लो और के लिए घूर्णन डिस्क रिएक्टर्स का प्रयोग करें Staphylococcus aureus Biofilm विश्लेषण

Published: December 27, 2010 doi: 10.3791/2470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan

ERRATUM NOTICE

Summary

ड्रिप प्रवाह रिएक्टरों के साथ खुला प्रणाली प्रवाह biofilms उपयोग और डिस्क रिएक्टरों घूर्णन के लिए प्रोटोकॉल में विस्तार से प्रस्तुत कर रहे हैं.

Abstract

प्रकृति में अधिकांश रोगाणुओं लगा रहे हैं biofilms में सतह से जुड़े समुदायों के रूप में मौजूद 1 बैक्टीरियल biofilms एक मैट्रिक्स के भीतर encased हैं और एक सतह 2 biofilm गठन और विकास से जुड़ी सामान्यतः microtiter प्लेटों या प्रवाह जैसे बैच सिस्टम का उपयोग कर प्रयोगशाला में अध्ययन कर रहे हैं प्रवाह कोशिकाओं के रूप में ऐसी प्रणालियों,. ये तरीके उत्परिवर्ती और रासायनिक पुस्तकालयों (microtiter प्लेटें) दृश्य (प्रवाह कोशिकाओं) 4 के लिए 3 या बढ़ रही biofilms स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी होते हैं. ड्रिप प्रवाह biofilm रिएक्टर और घूर्णन डिस्क biofilm रिएक्टर: यहाँ हम वर्तमान प्रवाह प्रणाली biofilms के दो अतिरिक्त प्रकार में बढ़ती Staphylococcus aureus के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल .

ड्रिप प्रवाह biofilm रिएक्टरों कम कतरनी शर्तों के अधीन हो biofilms के अध्ययन के लिए तैयार कर रहे हैं 5 ड्रिप प्रवाह रिएक्टर चार समानांतर परीक्षण चैनल, एक मानक कांच खुर्दबीन स्लाइड आकार कूपन के आयोजन की प्रत्येक सक्षम है, या कैथेटर या कार्यकाल की लंबाई के होते हैं. ड्रिप प्रवाह रिएक्टर microsensor निगरानी, ​​सामान्य अध्ययन biofilm, biofilm cryosectioning नमूने, उच्च बायोमास उत्पादन, चिकित्सा सामग्री, मूल्यांकन, और निबाह चिकित्सा उपकरण परीक्षण के लिए आदर्श है 6,7,8,9 .

घूर्णन डिस्क रिएक्टर एक teflon हटाने योग्य कूपन के लिए recesses युक्त डिस्क के होते हैं 10 हटाने योग्य कूपन द्वारा किसी भी machinable सामग्री से बनाया जा सकता है. घूर्णन डिस्क के नीचे एक बार चुंबक डिस्क रोटेशन सतह फ्लश कूपन भर में तरल सतह कतरनी बनाने के लिए अनुमति शामिल हैं. पूरे डिस्क युक्त 18 कूपन एक 1000 एमएल कांच की ओर हाथ रिएक्टर पोत में रखा गया है. एक तरल विकास मीडिया पोत के माध्यम से वितरित किया जाता है जबकि डिस्क एक चुंबकीय उत्तेजक द्वारा घुमाया गया है. कूपन रिएक्टर पोत से हटा रहे हैं और फिर आगे के अध्ययन या माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए biofilm नमूना इकट्ठा scraped. घूर्णन डिस्क रिएक्टरों biocide प्रभावकारिता, biofilm, हटाने, और विरोधी fouling सामग्री के प्रदर्शन की प्रयोगशाला मूल्यांकन के लिए डिजाइन किए हैं. 9,11,12,13

Protocol

1. ड्रिप फ्लो Biofilm रिएक्टर

  1. ड्रिप प्रवाह biofilm रिएक्टर (Biosurface टेक्नोलॉजीज या कस्टम डिजाइन संस्करणों से उपलब्ध आमतौर पर विश्वविद्यालय मशीन की दुकानों द्वारा बनाया जा सकता है है देखने के लिए, चित्रा 1) इकट्ठा होता है और autoclaved. विधानसभा कक्षों और हासिल चैम्बर lids में affixing कूपन शामिल है. biofilm (tryptic सोया शोरबा 2 ग्राम / एल और 2 ग्राम / एल ग्लूकोज) मध्यम, और influent पोषक तत्व टयूबिंग के साथ चैम्बर autoclaving द्वारा निष्फल रहे हैं.
  2. ड्रिप प्रवाह रिएक्टर का टीका एक सपाट सतह पर रखने रिएक्टर, प्रवाह टयूबिंग लाइनों clamping, 10 एमएल tryptic सोया शोरबा के साथ प्रत्येक कक्ष को भरने और एक एस के 10 μL जोड़ने द्वारा preformed है aureus संस्कृति tryptic सोया शोरबा में रात भर हो गया है . inoculated रिएक्टर फिर 18 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह.
  3. ऊष्मायन के 18 घंटे के बाद, प्रवाह टयूबिंग unclamped है और रिएक्टर एक लकड़ी के एक 10 ° कोण करने के लिए काट खंड पर रखा गया है.
  4. Aseptically सतत प्रवाह पोषक तत्व शोरबा युक्त बोतल के लिए influent पोषक तत्व टयूबिंग कनेक्ट. पंप और प्रधानमंत्री ट्यूबों के माध्यम से एक अधिकतम गति (पंप मॉडल के आधार पर अलग अलग होंगे) में पंप चलाकर टयूबिंग लाइन फ़ीड.
  5. एक बार influent टयूबिंग primed है पंप बंद करो और प्रत्येक ट्यूब के अंत करने के लिए कनेक्ट सुइयों (22 गेज, 1 इंच) देते हैं. एक इथेनॉल पोंछ और aseptically प्रवेश डाट के माध्यम से सुई सम्मिलित के साथ चैम्बर इनलेट डाट पोछो.
  6. पंप पर मुड़ें और मीडिया धीरे धीरे ड्रिप कूपन से अधिक (प्रवाह ~ 125 μL / मिनट की दर) की अनुमति. मीडिया नीचे कूपन के साथ प्रवेश डाट बंदरगाह से प्रवाह बंदरगाह के लिए प्रवाह चाहिए. सतत प्रवाह में 2-5 दिनों (आवेदन पर निर्भर करता है) के लिए रिएक्टर प्रचालन, कभी कभी उचित जल निकासी के लिए रिएक्टर की जाँच.
  7. ड्रिप प्रवाह रिएक्टर biofilms फसल, पंप बंद करो और ध्यान से रिएक्टर से सुइयों हटायें. रिएक्टर फिर एक सपाट सतह पर रखा जा सकता है और कूपन aseptically बाँझ संदंश का उपयोग कर हटाया जा सकता है. यदि माइक्रोस्कोपी वांछित है, कूपन अब तदनुसार संसाधित किया जा सकता है (चित्रा 2B एस aureus एक ड्रिप biofilm रिएक्टर में हो biofilm के एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ है). यदि biofilm बायोमास या शरीर विज्ञान के अध्ययन की मात्रा का ठहराव अध्ययन के लक्ष्य कर रहे हैं, biofilm एक सेल खुरचनी का उपयोग कूपन से हटाया जा सकता है है. हालांकि संदंश के साथ पकड़े कूपन, कूपन बंद धीरे एक शंक्वाकार फॉस्फेट युक्त ट्यूब में biofilm परिमार्जन खारा buffered एक सेल खुरचनी का उपयोग कर. नोट: biofilms में कॉलोनी बनाने इकाइयों यों के लिए, यह एक clumps disaggregate और एक समरूप निलंबन फार्म homogenizer ऊतक के साथ काटा biofilms homogenize करने के लिए आवश्यक है. ऊतक homogenizers के विभिन्न मॉडलों के इस आवेदन के लिए उपयुक्त हैं. हम 1 मिनट biofilm नमूने homogenize के लिए पूरी गति में एक फिशर साइंटिफिक Tissuemiser homogenizer (उत्पाद 15-338-420 #) का उपयोग. Biofilm homogenize विफलता कॉलोनी के एक मूल्यवान समझना नमूने में मौजूद इकाइयों के गठन में परिणाम होगा.

2. घूर्णन डिस्क Biofilm रिएक्टर

  1. घूर्णन डिस्क biofilm रिएक्टर (Biosurface टेक्नोलॉजीज से उपलब्ध से उपलब्ध या कस्टम किया जा सकता है, चित्रा 3 देखें) इकट्ठा होता है और autoclaved. पहली जगह द्वारा रिएक्टर इकट्ठा कताई डिस्क के स्लॉट में डिस्क कूपन कताई और यह एक अतिप्रवाह बंदरगाह के साथ एक 1 लीटर कांच बीकर में रखकर. मीडिया प्रवाह और वातन की अनुमति में drilled छेद के साथ संख्या 15 रबर डाट रिएक्टर टोपी के रूप में प्रयोग किया जाता है. रिएक्टर, biofilm मीडिया (tryptic सोया शोरबा 2 ग्राम / एल और 2 ग्लूकोज छ / एल), और प्रवेश टयूबिंग तो autoclaving द्वारा निष्फल रहे हैं.
  2. घूर्णन डिस्क biofilm रिएक्टर बाँझ माध्यम रिएक्टर में 250 MLS रखकर inoculated है, और एक रात एस के 0.5 एमएल जोड़ने aureus संस्कृति tryptic सोया शोरबा में हो गया है. रिएक्टर फिर हलचल 250 rpm के लिए सेट थाली पर रखा गया है और वांछित तापमान पर रातोंरात incubated.
  3. ऊष्मायन 16 घंटे के बाद बंदरगाह के लिए मध्यम जलाशय पर इनलेट टयूबिंग और कनेक्ट यह क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से कनेक्ट. तो पंप पर बारी है और प्रवाह ~ 0.25 एमएल / मिनट (प्रवाह वांछित विकास दर पर निर्भर करता है बदला जा सकता है है) करने के लिए सेट.
  4. 24 घंटे के बाद रिएक्टर बंद करो और aseptically biofilm कूपन छू बिना डिस्क हटाने. बाँझ संदंश का उपयोग कूपन निकालें और फॉस्फेट में हर एक डुबकी किसी भी शिथिल संलग्न बैक्टीरिया को दूर करने के लिए खारा buffered.
  5. रोगाणुरोधी यौगिक परीक्षण के लिए, चिप्स एक 96 अच्छी तरह से ब्याज की यौगिकों युक्त थाली के अलग - अलग कुओं में रखा जा सकता है है. ऊष्मायन के बाद, चिप्स 1.5 एमएल microcentrifuge 1 एमएल फॉस्फेट बफर खारा युक्त ट्यूबों में स्थानांतरित कर रहे हैं और एक ऊतक बरकरार biofilm फैलाने homogenizer के साथ homogenized.
  6. कक्ष फिर सीरियल पतला कर रहे हैं और पोषक तत्व अगर मध्यम पर चढ़ाया के लिए व्यवहार्य कॉलोनी formi निर्धारितएनजी इकाइयों.
  7. नोट: कई रूपों ऊपर प्रोटोकॉल पर बनाया जा सकता है है. उदाहरण के लिए, कताई डिस्क कूपन के साथ लेपित किया जा सकता है या संभावित विरोधी biofilm यौगिकों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए बाहर कर दिया. Biofilm dispersants dispersant यौगिकों और बढ़ाता संलग्न बनाम अलग बैक्टीरिया में कूपन हो incubating मूल्यांकन किया जा सकता है.

3. प्रतिनिधि परिणाम

ड्रिप प्रवाह रिएक्टर के ऊपर एक सेट का एक उदाहरण है अगर चित्र 1 में दिखाया गया है. Biofilm के प्रवाह के तीन दिनों के बाद कूपन सतह, चित्रा 2A पर प्रचुर मात्रा में जमा करेंगे. कुल बायोमास जीवाणु उपभेदों और सटीक विकास की स्थिति पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. एक एस के एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ aureus ड्रिप प्रवाह रिएक्टर में हो biofilm चित्रा 2B में दिखाया गया है.

एक घूर्णन डिस्क रिएक्टर आंकड़ा 3A में दिखाया गया है. वर्णित प्रोटोकॉल आमतौर पर किसी भी एक biofilm गठन के लिए सक्षम microorganism की विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. चित्रा 3B 18 प्लास्टिक डिस्क चिपका के साथ कताई डिस्क से पता चलता है. इन डिस्क हो biofilms विशेष रूप से अच्छी तरह से कर रहे हैं रोगाणुरोधी परीक्षण के लिए अनुकूल और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम 11 उपज.

चित्रा 1
चित्रा 1 ड्रिप प्रवाह रिएक्टर सेटअप. महत्वपूर्ण घटक लेबल रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 एक ड्रिप प्रवाह का उदाहरण है. एस aureus biofilm. एक) इस biofilm तीन दिन के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के बाद हो गया था. रिएक्टर के पहले दो कक्षों से Lids पीले एस दिखाने के लिए हटा रहे हैं aureus biofilm बायोमास. एक एस बी) Sacnning इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ aureus biofilm ड्रिप प्रवाह रिएक्टर में हो गया है.

चित्रा 3
चित्रा 3 घूर्णन डिस्क रिएक्टर. चल रहे एक कताई डिस्क रिएक्टर के उदाहरण). प्रमुख घटक लेबल रहे हैं. बी) एक कताई डिस्क के दृश्य बंद करें.

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Discussion

विभिन्न रिएक्टरों में हो Biofilms अक्सर विभिन्न विशेषताओं और प्रत्येक रिएक्टर अलग आवेदन किया है. एक ड्रिप प्रवाह biofilm रिएक्टर और एक rotating डिस्क रिएक्टर: इस काम में, हम दो biofilm रिएक्टरों के उपयोग का वर्णन. ड्रिप प्रवाह रिएक्टरों एक हवा तरल इंटरफेस पर कम कतरनी biofilms बढ़ के लिए उपयोगी होते हैं और स्थितियों की एक किस्म के लिए अनुकूलनीय रहे हैं. हम उन्हें बेहद अध्ययन में जहां biofilm बायोमास की एक बड़ी राशि वांछनीय है के लिए सुविधाजनक लगता है. इस सेटअप आसानी से microsensor निगरानी और संभावित antibiofilm सतहों परीक्षण शामिल अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

घूर्णन डिस्क रिएक्टर हटायें डिस्क पर एक उदारवादी कतरनी वातावरण के तहत कई समान biofilm से बढ़ के लिए उपयोगी है. इस रिएक्टर की क्षमता हटाने योग्य डिस्क पर एकाधिक समान biofilms उत्पादन रोगाणुरोधी यौगिकों और biofilm प्रतिरोधी सतहों के परीक्षण से जुड़े अध्ययन के लिए आदर्श बनाता है. कई अनुप्रयोगों संभव हो रहे हैं जब इन biofilm रिएक्टरों का उपयोग और शोधकर्ताओं के लिए सबसे अच्छा उनके विशिष्ट अनुसंधान की जरूरत मॉडल प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है.

इन प्रोटोकॉल प्रवाह सेल और स्थिर assays biofilms है कि अतीत में किया गया है और अधिक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया करने के लिए विकल्प प्रदान करते हैं. उन्होंने यह भी एक बड़ा विविध नैदानिक ​​संक्रमण की नकल करने की क्षमता प्रदान कर सकता है. हालांकि, वहाँ प्रत्येक तकनीक के साथ संभावित सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, ड्रिप प्रवाह रिएक्टरों और rotating डिस्क रिएक्टरों confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा biofilms दृश्यमान करने के लिए आदर्श नहीं हैं. इसके अलावा, रिएक्टरों के विभिन्न प्रकार में हो biofilms के फिजियोलॉजी की संभावना काफी भिन्न होगी. उदाहरण के लिए, ड्रिप - प्रवाह रिएक्टर एक गंभीर पोषक तत्व gradients उजागर biofilm, जो एक प्रवाह सेल biofilm भर में पोषक तत्व मीडिया की वर्दी लामिना का प्रवाह से बहुत अलग है में परिणाम होगा. अंततः, biofilm उपयोग रिएक्टर के प्रकार पर सवालों को संबोधित किया जा रहा निर्भर है और जांचकर्ताओं को पता है कि कई biofilm रिएक्टर प्रणाली उनकी पढ़ाई के लिए उपलब्ध हैं होना चाहिए.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

NIAID अनुदान K22AI081748.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drip Flow Reactors BioSurface Technologies Corporation DFR 110
Rotating Disk Reactors BioSurface Technologies Corporation

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References

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Tags

इम्यूनोलॉजी 46 अंक biofilm ड्रिप प्रवाह रिएक्टर घूर्णन डिस्क रिएक्टर खुला सिस्टम biofilm

Erratum

Formal Correction: Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. There was an error with an author's name. The author's middle initial was missing, this was corrected to:

Blaise R. Boles

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Blaise Boles.

ड्रिप फ्लो और के लिए घूर्णन डिस्क रिएक्टर्स का प्रयोग करें<em> Staphylococcus aureus</em> Biofilm विश्लेषण
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Schwartz, K., Stephenson, R.,… More

Schwartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. J. Vis. Exp. (46), e2470, doi:10.3791/2470 (2010).

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