El uso de un flujo de goteo y la rotación del disco para reactores Staphylococcus aureus Análisis de Biofilm

Summary

Protocolos para la utilización de abrir las biopelículas de flujo del sistema de reactores de flujo por goteo y la rotación de los reactores de disco se presentan en detalle.

Abstract

La mayoría de los microbios en la naturaleza se piensa que existen como asociados en la superficie las comunidades en las biopelículas. ¹ biofilms bacterianos están encerrados dentro de una matriz y unido a una formación de biopelículas de la superficie. ² y el desarrollo son comúnmente estudiados en el laboratorio con sistemas de lotes, tales como placas de microtitulación o el flujo de sistemas, como el flujo de las células. Estas metodologías son útiles para la selección de bibliotecas mutante y químicas (placas de microtitulación) ³ o en crecimiento para la visualización de biofilms (células de flujo) ^4. Aquí se presentan los protocolos detallados para el Staphylococcus aureus que crece en otros dos tipos de biofilms sistema de flujo: el flujo de goteo reactor biopelícula y el reactor de biofilm disco giratorio.

Goteo de reactores de biopelícula de flujo están diseñados para el estudio de las biopelículas se cultivan en condiciones de bajo cizallamiento. ⁵ El reactor de flujo de goteo consta de cuatro canales de prueba en paralelo, cada uno capaz de contener un microscopio estándar de vidrio de tamaño cupón de diapositivas, o un trozo de catéter o restricción. El reactor de flujo por goteo es ideal para el monitoreo de microsensores, los estudios generales de biofilm, las muestras de biofilm muestras criostáticas, alta producción de biomasa, material de las evaluaciones médicas y pruebas de mora en los dispositivos médicos. ^6,7,8,9

El reactor de disco giratorio se compone de un disco de teflón que contienen huecos de cupones desprendibles. ¹⁰ Los cupones desprendibles de puede hacerse de cualquier material mecanizable. La parte inferior del disco giratorio contiene un imán de barra para permitir la rotación del disco de corte para crear la superficie del líquido a través de la superficie al ras-cupones. Todo el disco contiene 18 cupones se coloca en un recipiente de 1000 ml de vidrio del reactor brazo lateral. Un medio de cultivo líquido se distribuye a través del vaso, mientras que el disco es girado por un agitador magnético. Los cupones se retiran de la vasija del reactor y luego raspar para recoger la muestra de biofilm para un estudio más o imágenes de microscopía. Rotación de los reactores de disco están diseñados para las pruebas de laboratorio de la eficacia biocida, la eliminación de biopelículas, y el rendimiento de los materiales anti-incrustantes. ^9,11,12,13

Protocol

1. El flujo de goteo Biofilm Reactor

1. El flujo de goteo reactor biopelícula (disponible en las tecnologías de Biosurface o versiones personalizadas diseñadas por lo general se puede hacer por talleres mecánicos universidad, ver Figura 1) se monta en autoclave. Asamblea consiste en la colocación de bonos en las cámaras y asegurar las tapas de cámara. La cámara, junto con el medio de biofilm (caldo de soja tríptico 2 g / L de glucosa y 2 g / L), y el tubo de nutrientes del afluente son esterilizados en autoclave.
2. La inoculación del reactor de flujo de goteo se realiza por colocar el reactor en una superficie plana, las líneas de tubería de sujeción de efluentes, llenando cada cámara con 10 ml de caldo de soja tríptico y la adición de 10 l de una S. cultura aureus crecido durante la noche en caldo de soja tríptico. El reactor se inoculó a continuación, coloque en una incubadora a 37 ° C durante 18 horas.
3. Después de 18 horas de incubación, los tubos de aguas residuales se suelta y el reactor se coloca en un bloque de madera cortada en un ángulo de 10 °.
4. Asépticamente conectar la tubería de nutrientes del afluente a la botella con el caldo de flujo de nutrientes continuo. Alimentar la línea de tubería a través de la bomba y los tubos de la primera mediante la ejecución de la bomba a una velocidad máxima (varía según el modelo de la bomba).
5. Una vez que la tubería del afluente se prepara detener la bomba y colocar las agujas se conectan (calibre 22, 1 pulgada) del extremo de cada tubo. Limpie el tapón de entrada de la cámara con una mezcla de etanol y limpiar asépticamente insertar las agujas a través del tapón de entrada.
6. Encienda la bomba y permita que los medios de comunicación a gotear lentamente (caudal ~ 125 l / min) en los cupones. Los medios de comunicación debe fluir hacia abajo a lo largo del cupón desde el puerto de entrada de tapón en el puerto de efluentes. Operar el reactor en flujo continuo durante 2-5 días (dependiendo de la aplicación), de vez en cuando comprobar el reactor de un drenaje adecuado.
7. Para cosechar las biopelículas de flujo de goteo reactor, detenga la bomba y retire con cuidado las agujas del reactor. El reactor puede ser colocado sobre una superficie plana y los cupones pueden ser asépticamente usando una pinza estéril. Si la microscopía se desea, los cupones ya se pueden procesar en consecuencia (Figura 2B es una micrografía electrónica de barrido de una biopelícula S. aureus crecido en un reactor de biofilm por goteo). Si la cuantificación de la biomasa de biofilm o estudios de fisiología son el objetivo del estudio, el biofilm puede ser removido de el cupón con un rascador de células. Mientras mantiene los cupones con las pinzas, raspar suavemente el biofilm el cupón en un tubo cónico que contiene tampón fosfato salino usando un raspador de células. Nota: para cuantificar las unidades formadoras de colonias en las biopelículas, es necesario homogeneizar los biofilms cosechadas con un pañuelo de papel homogeneizador de desagregar grupos y formar una suspensión homogénea. Varios modelos de homogeneizadores de tejidos son adecuados para esta aplicación. Utilizamos un Fisher Scientific Tissuemiser homogeneizador (producto # 15-338-420) a toda velocidad por 1 minuto para homogeneizar las muestras de biofilm. La falta de homogeneización de la biopelícula se traducirá en una subestimación de las unidades formadoras de colonias presentes en la muestra.

2. El disco giratorio del reactor biopelícula

1. El reactor de disco giratorio biofilm (disponible a partir de las tecnologías disponibles Biosurface o puede ser por encargo, ver Figura 3) está montado y autoclave. Montar el reactor por el primer lugar de la gira del disco cupones en las ranuras del disco giratorio y colocarlo en un vaso de vidrio de 1 litro con un puerto de desbordamiento. Un número de 15 tapón de goma con agujeros en ella para permitir el flujo de los medios de comunicación y la aireación se utiliza como la tapa del reactor. El reactor, biofilm medios (caldo de soja tríptico 2 g / L de glucosa y 2 g / L), y el tubo de entrada se esteriliza en autoclave.
2. El reactor de disco giratorio biofilm se inocula mediante la colocación de 250 ml de medio estéril en el reactor, y la adición de 0,5 ml de un día para otro S. cultura aureus crecido en caldo de soja tríptico. El reactor se coloca sobre una placa de agitación conjunto a 250 rpm y se incubaron durante la noche a la temperatura deseada.
3. Después de 16 horas de incubación conectar la tubería de entrada al puerto en medio de depósito y conectarlo a la bomba peristáltica. La bomba se encienda y el flujo ajustado a ~ 0.25 mL / min (flujo puede ser alterado en función de la tasa de crecimiento deseado).
4. Después de 24 horas parada del reactor y asépticamente retire el disco sin tocar los cupones de biofilm. Eliminar los cupones con pinzas estériles y baño cada una en tampón fosfato salino para eliminar las bacterias unen libremente.
5. Para las pruebas de compuestos antimicrobianos, los chips pueden ser colocados en los distintos pozos de una placa de 96 pocillos que contienen compuestos de interés. Después de la incubación, los chips se transfieren a tubos de 1,5 mL microcentrífuga que contiene 1 ml de solución salina tampón fosfato y se homogeneiza con un homogeneizador de tejidos para dispersar a la biopelícula intacto.
6. Las células se diluyen en serie y se colocaron en un medio de agar nutriente para determinar viable colonia Formiunidades ng.
7. Nota: muchas variaciones se pueden hacer en el protocolo anterior. Por ejemplo, haciendo girar el disco cupones pueden ser recubiertos con o hechos de potencial anti-biopelículas compuestos para probar su eficacia. Dispersantes biofilm también se puede evaluar que la incubación de los cupones de compuestos dispersantes y cuantificar las bacterias frente unido separado.

3. Resultados representante

Un ejemplo de un montaje del reactor de goteo de flujo se muestra si la figura 1. Después de tres días de flujo de grandes cantidades de biofilm se acumulan en la superficie del cupón, la figura 2A. La biomasa total variará dependiendo de las cepas bacterianas y las condiciones precisas de crecimiento. A Micrografía electrónica de barrido de una S. biofilm aureus cultivados en el reactor de flujo de goteo se muestra en la Figura 2B.

Un reactor de disco giratorio se muestra en la figura 3A. El protocolo descrito se puede adaptar a las necesidades específicas de general, cualquier microorganismo capaz de formar una biopelícula. Figura 3B muestra el disco giratorio con 18 discos de plástico colocada. Estas biopelículas crecido en disco son especialmente adecuados para las pruebas antimicrobianas y con unos resultados altamente reproducibles ^11.

Figura 1. El flujo de goteo de configuración del reactor. Componentes importantes son etiquetados.

Figura 2. Ejemplo de un flujo de goteo S. aureus biofilm. A) El biofilm creció durante tres días siguiendo el protocolo descrito. Las tapas de los primeros dos cámaras del reactor se retiran para mostrar la amarilla S. aureus biofilm de la biomasa. B) Sacnning micrografía electrónica de una S. biofilm aureus cultivados en el reactor de flujo por goteo.

Figura 3. El reactor de disco giratorio. A) Ejemplo de un reactor de disco giratorio corriendo. Componente clave están etiquetados. B) Cierre de vista de un disco giratorio.

Discussion

Biofilms cultivados en reactores diferentes a menudo tienen características diferentes y cada uno tiene diferentes aplicaciones del reactor. En este trabajo se describe el uso de dos reactores de biopelícula: un flujo de goteo reactor biopelícula y un reactor de disco giratorio. Goteo de reactores de flujo son útiles para el cultivo bajo las biopelículas de corte en una interfase aire-líquido y son adaptables a una variedad de condiciones. Los encontramos muy conveniente para los estudios en los que una gran cantidad de biomasa biofilm es deseable. Esta configuración se puede adaptar fácilmente para estudios con control de microsensores y el análisis de superficies antibiofilm potencial.

El reactor de disco giratorio es útil para el crecimiento de biofilm idénticas múltiples discos de eliminar en un entorno de corte moderado. La capacidad de este reactor para producir varias películas biológicas idénticas en los discos extraíbles lo hace ideal para los estudios con las pruebas de compuestos antimicrobianos y las superficies de biofilm resistente. Muchas aplicaciones son posibles cuando se utilizan estos reactores de biopelícula y los investigadores se les anima a modificar el protocolo para el mejor modelo a sus necesidades específicas de investigación.

Estos protocolos proporcionan alternativas a la celda de flujo y ensayos de biofilms estática que se han utilizado más ampliamente en el pasado. También pueden proporcionar una mayor capacidad para imitar diversas infecciones clínicas. Sin embargo, existen limitaciones potenciales a cada técnica. Por ejemplo, los reactores de flujo de goteo y la rotación de los reactores de disco no son las ideales para la visualización de biofilms por microscopía confocal. Además, la fisiología de las biopelículas crecido en los diferentes tipos de reactores es probable que varíe mucho. Por ejemplo, el reactor de flujo de goteo se traducirá en un biofilm la exposición severa gradientes de nutrientes, lo cual es muy diferente del flujo laminar uniforme de los medios de cultivo a través de un biofilm celda de flujo. En última instancia, el tipo de reactor de biofilm utilizada dependerá de las preguntas que se trate y los investigadores deben ser conscientes de que múltiples sistemas de reactores de biopelícula están disponibles para sus estudios.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drip Flow Reactors	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
Rotating Disk Reactors	BioSurface Technologies Corporation