편광 상피 세포에 Plasmids의 Microinjection에 의해 작은 GTPases의 기능을 분석

Summary

이 문서는 자세한 microinjection 기술을 사용하여 편광 상피 세포의 작은 GTPases의 overexpression 및 분석에 관련된 절차를.

Abstract

혀끝의 도메인이 '무료'표면을 얼굴 basolateral 세포막이 기판과 이웃 세포와 접촉에 화학적 및 기능 뚜렷한 혀끝의과 basolateral 도메인으로 자신의 플라즈마 막 분극 상피 세포. 두 멤브레인 도메인은 확산 장벽을 형성 꽉 분기점에 의해 구분됩니다. 이러한 마딘 - 다비 케이 나인 신장 (MDCK) 세포로 상피 세포가 폴리 카보 네이트 필터에서 높은 밀도의 씨앗을 품고 여러 일 ^{1 2} 양식 때 혀끝의 - basolateral 분극은 문화에 성공적으로 recapitulated 수 있습니다. 세포 극성의 구축 및 유지 보수는 그러한 RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 및 Rab13 ^{3 4 5 6 7로} 라스의 superfamily의 작은 GTPases의 배열에 의해 규제됩니다. 비활성 GDP - 바운드 상태와 활성 GTP - 바운드 주 사이의 모든 GTPases와 마찬가지로 이들 단백질은 사이클. 뉴클레오 티드 바인딩 지역의 특정 돌연변이 자전거 ⁸ 방해. 예를 들어, Rab13T22N는 영구적으로 GDP - 형태로 고정하기 때문에 '부정적인 지배'로 명명됨, Rab13Q67L 더 이상 GTP를 hydrolyze 수없는 반면에 있으므로 '지배 운영중'상태 ⁷ 잠겨입니다. 그들의 기능을 분석하는 셀에 GTPases 모두 지배적인 부정과 지배 적극적인 대립 유전자는 일반적으로 내생 단백질 ^구의 기능을 방해하는 높은 수준에서 표현됩니다. 짧은 시간 금액에 overexpression 높은 수준을 달성하기 우아한 방법은 필터 microinjection 기술을 사용하여 지원에 성장 양극 세포의 핵에 직접 관련 단백질을 인코딩 plasmids을 소개하는 것입니다. 이것은 종종 특히 혀끝의 또는 basolateral 도메인에 정렬됩니다 플라즈마 막 수용체를 인코딩 기자 plasmids의 공동 주사와 결합됩니다. 자주 basolateral 도메인에 정렬화물을 분석하는 데 사용되는화물은 기공을 갖는 구염 바이러스 당단백질 (VSVGts045) ¹⁰ 이상의 온도에 민감한 allele입니다. 이 단백질은 39 ° C에서 제대로 접을 수 없어 관심의 규제 단백질이 cytosol에서 조립하는 동안 따라서 endoplasmic reticulum (ER)에 유지됩니다. 31 이동 ° C 다음 VSVGts045는 플라즈마 막 ¹¹ 응급실에 여행을 제대로 접어 떠날 수 있습니다. 이 추적은 일반적으로 청소기 결과를 선도하는 추가의 단백질 합성을 방지하기 위해 cycloheximide의 존재에서 수행됩니다. 여기 상세 basolateral 정렬에 관련된 규제 단백질의 포괄적인 분석을 허용 온도 교대를 포함하여 편광 세포와 후속 incubations에 plasmids를 microinjecting의 절차를 설명합니다.

Protocol

1. 플라스미드 DNA의 분리

1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 내독소 무료로 DNA를 준비하는 시그마 - 알드리치 내독소 무료 maxiprep 키트를 사용하십시오. 그것이 안정적으로 DNA의 준비로부터 endotoxins를 제거하기 때문에이 키트는 우리를 위해 작동합니다. 세포 핵에 DNA을 주사 Endotoxins는 세포 죽음을 초래합니다.
2. 분리된 DNA, 소용돌이 및 Eppendorf의 microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 1 분 스핀 100 μl 페놀 / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1)을 추가합니다. 새로운 튜브로 상부 급수 단계를 전송 100 μl 클로로포름 / isoamylalcohol (24:1), 위와 같이 소용돌이와 스핀을 추가합니다. 새로운 튜브로 DNA를 포함하는 상부 물 위상을 전송합니다. 이 단계는 microinjection 바늘의 막히는 것을 방지 DNA에서 어떤 단백질을 제거하는 필요합니다.
3. 300 MM X 2 권 100 % 에탄올의 최종 농도 나 아세테이트 (산도 6.0)을 추가하여 DNA를 침전. 하룻밤 -20 ° C에서 알을 품다. Eppendorf의 microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 20 분에 대한 DNA를 스핀, 70 % 에탄올로 한 번 씻어, 300 μl 내독소 - 무료 물 (시그마 - 알드리치)에 resuspend.
4. DNA 농도를 결정합니다. 일반적인 DNA의 농도는 1에서 5 μg / μl 범위.

2. MDCK 세포의 문화

1. MDCK 세포를 분리. 세포 및 종자 4 카운트 취소 12 mm 트랜 스웰 필터 (0.4 μm의 기공 크기, 코닝 코스타, 3460)로 X 10 ⁵ 세포. 모의 분사 제어 및 종자 세 필터를 필요 두 개의 서로 다른 돌연변이 RAB의 단백질을 포함하는 실험.
2. 이 MM L - 글루타민, 37에서 0.1 MG / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 7 % (권 / 권) 태아 소 혈청 (= 멤 성장 미디어) ° C와 5% CO _2. 함께 멤 매체 문화 MDCK 세포
3. 매일 basolateral 챔버에서 미디어를 변경합니다. 그것이 동물의 상피 세포의 상황을 모방하기 때문에 이것은 편광 과정을 보조.
4. 세포가 닫힌 monolayer에 성장하고 있는지 여부를 현미경 2 일 이후 시딩 체크. 당신이 monolayer에 구멍을 검색할 수없는 경우, 3 일에 실험을 수행합니다. 구멍이 아직있다면, 하루 4 실험을 수행합니다.

3. Microinjection 절차 및 사후 분사 Incubations

1. 실험 당일 39 ° C 배양기에 5 ML의 멤 성장 미디어 플러스 각 필터 및 장소에 대해 하나 60 X 15mm 판 50 MM HEPES를 준비합니다. 또한, 1 ML 멤 성장 미디어 플러스 50 MM HEPES 및 0.1 MG / ML cycloheximide 당 필터, 그리고 31 ° C 배양기에 장소 12 잘 플레이트 잘 하나가 설정할 수 있습니다.
2. 귀하의 microinjection 현미경의 전원을 켜고 39의 가열 무대 ° C. 우리는 열띤 무대로 바뀌 현미경 (Axiovert 200, 칼 자이스 혈구 MicroImaging 주식 회사), 10X 32X과 목표, 그리고 Eppendorf Femtojet (Injectman NI2)를 사용합니다. 마지막으로, 질소와 공기 테이블을 공급 질소 가스 탱크를 엽니다.
3. 100 μl - 10의 총 볼륨의 0.2 MG / ML의 최종 농도 필터링된 물 (0.2 μm의 필터를 사용하여)와 DNA를 희석. 그 후, 30 분 13,000 rpm으로 Eppendorf의 microcentrifuge에서 DNA를 스핀. 새로운 튜브에 최고 부분과 장소를 제거합니다. 이 단계는 microinjection 바늘로 희석 DNA를 로드할 때 정확하게 "깨끗한"DNA를 로드할 수있는 처​​리됩니다. 당신의 DNA는 지금 microinjection 준비가되었습니다.
4. 문화 요리의 첫 번째 필터 밖으로 복용하여 세포를 준비합니다. 외과 블레이드 (깃털 외과 블레이드, 스테인레스 스틸, 아니 11), 5 ML, 39 ° C 따뜻한 멤 성장 미디어 플러스 50 MM HEPES (60 X 15mm 판)에 필터 홀더와 장소에서 필터를 잘라 함께. 당신이 그것을 밖으로 절단에 사용되는 수술 칼날과 문화 접시에있는 필터를 아래로 무게. 수술 칼날의 구멍이 필터의 중앙을 둘러싸는 것을 필터 등에 놓으십시오. 현미경의 온수 무대에 여러분의 문화 접시를 놓습니다.
5. microinjection 니들 (Femtotip II, Eppendorf, 930,000,043)에 희석 DNA (이 경우 plasmids 인코딩 VSVGts045 - GFP에서 = 모의 분사 제어)로부터 2-3 μl를로드, 바늘의 보호 커버를 비틀어하고 바닥에 떨어뜨 리다 . 이제 바늘의 소유자로 실수를 할 준비가되어 있습니다. 이렇게하려면 injectman의 메뉴 키를 눌러하여 밸브가 종료되었는지 확인하십시오. 의 홀더에 바늘 나사, 그 파손을 초래할 수 있으므로 너무 단단히 바늘에 나사하지 조심하십시오. 이제 다시 메뉴 키를 적용 P _C는 microinjeciton 절차 동안 바늘로 빨려에서 미디어를 방지할 수 있습니다. 마지막으로 저장된 유도를 삭제하여 조이스틱을 누릅니다.
6. 세포에 바늘을 줄이려면 10X 목적을 사용하여 액체 위의 광선에 바늘을 가지고. 지금 세포에 초점 휠에게 180 선회 최대로 다시 포커스를 가지고 집중하고, 바늘을 찾으십시오. 그 후, 천천히 (다시 초점으로 세포를 데리고 나갈 수) 다시 초점 밖으로 내보일 후, 초점에 바늘을 이동에 대한에 바늘을 가지고다시 cus. 니들이 언론의 표면을 건드리면 때까지 반복하는 지점이 표시됩니다 모든 후광입니다. 당신이 세포가 초점에되는 지점에 도달하지만 바늘이 (초점 비행기 즉, 밖으로) 여전히 32X 목표 및 고급 설정 변경 굵은 퍼지 경우.
7. 바늘 끝과 혀끝의 멤브레인를 감동 핵으로 10 μm의 약 공제한 혀끝의 막 아래에 약 10 μm의를 누워하여 Z - 한도를 설정합니다.
8. 당신이 Z - 한도를 설정한 후, 오른쪽 사출 압력을 찾으십시오. 95 PSI에서 시작합니다. 압력이 너무 높은 경우, 전지가 폭발합니다. 귀하의 압력이 너무 낮으면, 당신은 유지 흰 점이 표시되지만 다른 아무것도 나타나지 않습니다. 성공적인 주사로, 당신은 셀 크기를 변경하지 않고 위상 변화를 볼 수 있습니다. 사출 들어, 최대한 빨리 초점 비행기의 바늘에게 미크론의 몇을 가지고. 핵 위에 바늘 (즉, 개별 세포의 중간)와 조이스틱의 사출 버튼을 누르면 목표로하지만, 버튼을 길게하지 않습니다.
9. 당신의 세포에 자리잡고하여 수술 블레이드의 구멍 내에 100-500 세포를 주사. 작업이 완료되면, 2 H.위한 문화 요리와 수술 칼날 39 ° C 배양기로하고, 부화하여 세포를 배치 이 기간 동안 VSVGts045 - GFP가 표현되고 응급실에 분비. 그러나, 39 ° C에서, VSVGts045 - GFP가 제대로 배 수없고 따라서 응급실을 떠날 수 없습니다. 한편, 관심의 작은 GTPase는 공동 분사 실험에서 cytosol에 축적됩니다.
10. 2 H 후, 31 ° C. 2 H 위해 12 잘 플레이트와 부화 1 ML 멤 성장 미디어 플러스 50 MM HEPES 및 0.1 MG / ML cycloheximide에 세포를 배치 이 추적 기간 동안, VSVGts045 - GFP가 제대로 배 응급실에두고 세포 표면에 전달됩니다.
11. (plasmids 인코딩 VSVGts045 - GFP를 삽입하고 예를 들어 Rab13Q67L를 V5 - 태그) 필터를 두 (plasmids 인코딩 VSVGts045 - GFP를 삽입하고 예를 들어 Rab13T22N를 V5 - 태그) 세에 대한 3.10 - 3.1 단계를 반복합니다. 각 분사가 20 정도 걸릴 거예요 - 60 분. 당신이 세포를 수정하기 전까지 그러나, 그것은 온도 변화의 incubations와 표면 얼룩을 통해 모든 필터도 동일한 방식으로 처리하기 위해 절대적으로 중요합니다. 고정 후, 당신은 동시에 모든 필터에 대한 얼룩 프로토콜의 나머지 부분을 수행할 수 있습니다.

4. Immunofluorescence 분석을위한 표면 스테 이닝

참고 VSVGts045 - GFP의 GFP 신호의 표백 방지하기 위해, 이후의 모든 절차 중에 알루미늄 호일로 덮고하여 빛으로부터 표본을 보호합니다.

1. 당신이 표면 얼룩을 수행하고자하는 경우, 얼음에 금속 접시에 문화 접시에서 세포를 넣고 얼음 차가운 PBS ^{2 +} (PBS [0.2 g / 리터 KCl, 0.2 g / 리터 KH ₂ PO ₄ 1X 너의 세포를 씻어 8g / 리터 NaCl, 그리고 2.17는 g / 리터 나 ₂ HPO ₄ X 7 H ₂ O] 플러스 0.1 g / 리터 CaCl ₂ 0.1 g / 리터 MgCl ₂ X 6 H ₂ O). 그 후, 장소이 경우에는 단백질의 ectodomain을 인식 항체의 30 μl 마우스 단클론 항체 TK1 (IgG _1, 후반 토마스 크라 이스에서 얻은), 얼음에 금속 플레이트에 위치 깨끗한 parafilm에. 거꾸로 드롭에 귀하의 세포와 필터를 배치하여 필터의 뒷면에 항체의 몇 방울을 추가합니다. 얼음 1 H에 대해 품어.
2. 12 잘 판에 플레이스 세포는, 얼음 차가운 PBS ² 배 세척 ⁺ (또는 RT 따뜻한 PBS ^{2 +} 전에 표면의 얼룩없이), 그리고 RT 15 분 3 % paraformaldehyde로 수정.
3. PBS ^{2 +로} 한번 세포를 씻고 ⁺ 5 분 PBS ² 둡니다.
4. / permeabilization 버퍼 (BPB) (2 % [WT / 권] BSA, 0.4 % [WT / 권] PBS ² 사포닌 ⁺⁾ 10 % [권 / 권] 염소 혈청을 차단에서 세포를 품어. RT 1 H를 품어.
5. 이 예제 BPB의 안티 - V5 (마우스 단클론 항체 IgG _2A, Invitrogen), 1:200에서 표현 RAB GTPase를 감지하는 기본 항체를 희석. 13,000 RPM 10 분 Eppendorf의 microcentrifuge에 희석 항체를 스핀. 깨끗한 parafilm에 항체 솔루션의 장소 30 μl가 젖은 챔버에 배치. 거꾸로 항체 드롭에 필터 세포를 놓고 RT 1 H에 대해 숙고하다.
6. 12 잘 플레이트와 RT에서 BPB 30 분 이상 5 배 세척에 다시 플레이스 셀 (오른쪽까지).
7. 이 경우에는 염소 안티 - 마우스 IgG ₁ 알렉사 (표면에 탐지 VSVG 들어, Invitrogen) 594 - 라벨 및 Cy5 - 라벨 이차 항체가이 예제의 염소에 당신의 RAB의 GTPase를 인식 안티 - 마우스 IgG _2A에서 적절한 보조 항체를 희석 BPB로 1:200 (잭슨 ImmunoResearch) Cy5 - 표시 및 상기 스핀. 다운 항체 드롭에 필터를 거꾸로에 젖은 챔버 및 장소 세포에서 깨끗한 parafilm에 플레이스 30 μl 항체 솔루션입니다. RT 1 H를 품어.
8. 4.6 단계를 반복합니다.
9. 탈이온수 및 장소 R로 배 필터 딥 세포microslides에 항공 측면까지. 세포의 상단에 10-15 μl 마운트 (10 % 증류수에 [WT / 권] DABCO 50 % [WT / 권] 글리세롤) 추가합니다. 상단과 얼굴 조직을 사용하여 플레이스 18X18 mm 마이크로 커버 유리 부드럽게 세포에 마이크로 덮개 유리를 누르십시오. 매니큐어로 밀봉합니다.
10. 공촛점 현미경으로 표본을 분석할 수 있습니다. 우리는 63X 물 침지 렌즈를 갖춘되었다 Microsystem LSM 510, 칼 자이스 혈구 MicroImaging 주식 회사를 사용합니다.
11. 그림의 준비를 위해, 조정 등 어도비 포토샵과 어도비 일러스트 레이터와 같은 프로그램을 사용하여 이미지를 결합하여.

5. 대표 결과

작은 GTPases의 공동 표현은 정렬을 VSVG을 방해하는 방법에 대한 예제를 보려면 친절하게 혀끝의 missorting ^{3, 4} 또는 표면 전달 ⁷ 억제 하나에 대해 게시된 기사를 참조하십시오.

그림 1. 표면 얼룩 (빨강, 그림 1에있는)에 의해 판단으로 모의 분사에서 단지 인코딩 플라스미드 VSVGts045 - GFP의 주사를 즉, 단백질은 잘 편광 MDCK 세포의 basolateral 표면에 배달됩니다. 모든 VSVGts045 - GFP의가 31 추적하는 동안 basolateral 멤브레인 전달됩니다 ° C로 전체 단백질에 대한 광범위한 세포 신호에 의해 입증 (녹색 1, A와 B에게 피규어). 잘 편광되지 않은 세포 VSVGts045 - GFP는 혀끝의 멤브레인 (그림 1 B) 또한 전달됩니다. 컨트롤의 표본은 그림 1에서 B 세포처럼 보인다면, 당신은 귀하의 데이터를 신뢰하고 ​​더 나은 - 양극 세포와 실험을 반복 수 없습니다. 스케일 바 5 μm의 수 있습니다.

Discussion

성공 microinjection 실험을위한 가장 중요한 단계는 DNA와 세포의 극성의 품질과 순도 있습니다. 양극 세포없이 사출 제어 이미 VSVG을 mistargeted가되며 실험은 사용할 수 없습니다. DNA는 질이 나쁜 경우, DNA가 가난한 사람들에게 최고의 사출 바늘 또는 모두에 원하는 단백질없이 표현을 방해할 수 있습니다. 또한, 같은 pRKV 같은 높은 표현 수준으로 이어질 것으로 알려진 표현 plasmids를 사용하는 것이 좋습니다입니다.

다른화물 단백질의 분류에 대한 테스트를 원하는 경우, 온도 변화 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 밀도 지단 백질 수용체를 표현하기 위해, 우리는 37 microinjection을 수행 ° 37 1 H 보육 다음 C ° C, 20 4 H ° C (TGN에서화물을 체포하기 위해) 37 2 H ° 0.1 MG / ML cycloheximide의 존재에 C는 표면에 단백질을 추적합니다. 이러한 FC 수용체 같은 단백질의 경우, 20에서 배양 시간 ° C는화물 단백질을 합성하는 방법 빠른에 따라 2 H로 낮추어 수 있으며 분비 경로를 통해 여행. 들어 우리가 다른화물 단백질에 사용되는 incubations에 대한 자세한 설명은 2008 년 ⁷ 녹스 외 있습니다. 참조하십시오.

마지막으로,이 프로토콜은 작은 GTPases의 분석뿐만 아니라 사용할 수 있지만 의심되는 모든 단백질이나 단백질 조각에 대한 이론 (편광) 표면 배달의 기능을 할 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage	Carl Zeiss, Inc.	Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator	Eppendorf	Custom order
Femtotips II (Microinjection needles)	Eppendorf	930000043
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Clear 12-mm transwell filter supports	Corning	3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit	Sigma-Aldrich	NA0400