El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Summary

Este artículo detalla los procedimientos involucrados en la sobreexpresión y el análisis de las pequeñas GTPasas en células epiteliales polarizadas utilizando la técnica de microinyección.

Abstract

Las células epiteliales polarizar su membrana plasmática en los dominios apical y basolateral de vista bioquímico y funcionalmente diferentes, donde el dominio apical se enfrenta a la 'libre' y las superficies de la membrana basolateral está en contacto con el sustrato y las células vecinas. Ambos dominios de la membrana están separados por uniones estrechas, que forman una barrera de difusión. Apical-basolateral polarización se pueden recapitular con éxito en el cultivo cuando las células epiteliales como el riñón canino Madin-Darby (MDCK) se siembran a alta densidad en los filtros de policarbonato y se cultivan durante varios días ^{1 2.} Establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular está regulado por una serie de pequeñas GTPasas de la superfamilia Ras como Rala, Cdc42, Tab8, Rab10 y Rab13 ^{3 4 5 6 7.} Al igual que todas las GTPasas estas proteínas del ciclo entre una inactivos PIB determinada del Estado y un Estado activo GTP. Mutaciones específicas en las regiones de unión de nucleótidos interferir con este ciclo de ^8. Por ejemplo, Rab13T22N está permanentemente encerrado en el PIB de forma y por lo tanto llamado "dominante negativo", mientras que Rab13Q67L ya no pueden hidrolizar GTP y por lo tanto encerrado en una "dominante activo" del Estado ^7. Para analizar su función en las células de los dos alelos dominantes negativos activa y dominante de GTPasas se suelen expresar en niveles altos para interferir con la función de las proteínas endógenas ^9. Una manera elegante de alcanzar altos niveles de sobre-expresión en un corto período de tiempo es la introducción de los plásmidos que codifican las proteínas relevantes directamente en los núcleos de las células polarizadas crecido en el filtro admite el uso de la técnica de microinyección. Esto se combina a menudo con la co-inyección de reportero plásmidos que codifican los receptores de la membrana plasmática que están específicamente ordenados en el dominio apical o basolateral. Una carga usados ​​para analizar la carga de clasificación para el dominio basolateral es un alelo sensible a la temperatura de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVGts045) ^10. Esta proteína no se pueden plegar correctamente a 39 ° C y por lo tanto se mantendrá en el retículo endoplasmático (ER), mientras que la proteína reguladora de interés se monta en el citosol. Un cambio a 31 ° C, entonces permitirá que VSVGts045 a veces bien, salir de la sala de emergencia y los viajes a la membrana plasmática ^11. Esta persecución se realiza generalmente en presencia de cicloheximida para prevenir la síntesis de proteínas mayor que conduce a resultados más limpios. A continuación se describe en detalle el procedimiento de la microinyección de plásmidos en células polarizadas y incubaciones posteriores incluyendo los cambios de temperatura que permiten un análisis completo de las proteínas reguladoras implicadas en la clasificación basolateral.

Protocol

1. Aislamiento de ADN plásmido

1. Use un libre de endotoxinas Sigma-Aldrich kit maxiprep para preparar ADN endotoxinas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Este kit funciona para nosotros, ya que elimina las endotoxinas de forma fiable a partir de preparaciones de ADN. Endotoxinas que se les inyecta el ADN en los núcleos celulares se llevan a la muerte celular.
2. Añadir 100 ml de fenol / chlorofom / isoamilalcohol (25:24:1) para el ADN aislado, vórtice y vuelta durante 1 minuto a 13.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf. Transferir la fase superior del agua en un tubo nuevo y añadir 100 ml de cloroformo / isoamilalcohol (24:1), vórtice y el giro que el anterior. Transferir la fase superior del agua que contiene el ADN a un tubo nuevo. Este paso es necesario para eliminar las proteínas del ADN, lo que evita la obstrucción de la aguja de microinyección.
3. Precipitar el ADN mediante la adición de acetato de sodio (pH 6,0) a una concentración final de 300 mm y 2 x etanol 100% vol. Se incuba a 20 ° C durante la noche. Giro de ADN durante 20 minutos a 13.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf, lavar una vez con etanol al 70%, y resuspender en 300 libre de endotoxinas l de agua (Sigma-Aldrich).
4. Determinar la concentración de ADN. A la concentración de ADN típico varía de 1 a 5 g / l.

2. Cultivo de células MDCK

1. Dividir las células MDCK. Recuento de células y las semillas de 4 X 10 ⁵ células en claro de 12 mm filtros Transwell (0,4 micras de tamaño de poro, Corning Costar, 3460). Para un experimento de control que contiene una inyección simulada y dos diferentes proteínas Rab mutante que necesita para sembrar tres filtros.
2. Cultura células MDCK en medio MEM con 2 mM L-glutamina, 0,1 mg / ml de penicilina / estreptomicina y el 7% (vol / vol) de suero fetal bovino (= medios de cultivo MEM) a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
3. Cambiar los medios de comunicación en la cámara basolateral todos los días. Esto ayuda al proceso de polarización, porque se parece a la situación de las células epiteliales de los animales.
4. Dos días después de la siembra de verificación en un microscopio si las células están creciendo en una monocapa cerrados. Si usted no puede detectar todos los agujeros en la monocapa, lleve a cabo su experimento en el día 3. Si todavía hay agujeros, realizar su experimento en el día 4.

3. Microinyección Procedimiento y incubaciones de post-inyección

1. En el día del experimento preparar 5 ml de medio de cultivo MEM más HEPES 50 mM en una placa de 60 mm x 15 para cada filtro y coloque en un 39 ° C incubadora. Además, estableció un pocillo de una placa de 12 pocillos con un medio de cultivo MEM ml más 50 mM de HEPES y 0,1 mg / ml de cicloheximida por filtro, y el lugar en una incubadora de 31 ° C.
2. Encienda el microscopio de microinyección y establecer su etapa calienta a 39 ° C. Nosotros usamos un microscopio invertido (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) con una etapa de calefacción, los objetivos 10X y 32X, y una FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Por último, abra el tanque de gas nitrógeno, que abastece a la mesa de aire con nitrógeno.
3. Diluir el ADN con agua filtrada (0,2 micras uso del filtro) a una concentración final de 0,2 mg / ml en un volumen total de 10 - 100 l. Posteriormente, el giro de ADN en microcentrífuga Eppendorf a 13.000 rpm durante 30 min. Quítele la parte superior y colocar en un tubo nuevo. Este paso asegura que cuando se carga el ADN diluido en la aguja de microinyección con precisión puede cargar "limpia" de ADN. Su ADN está listo para la microinyección.
4. Preparar a las células mediante la adopción de el filtro primero de su placa de cultivo. Con una hoja de bisturí (Blade pluma quirúrgica, acero inoxidable, n º 11), corte el filtro del soporte del filtro y el lugar en 5 ml, 39 ° C calentar el medio de crecimiento MEM más 50 mM HEPES (60 x 15 mm plato). Pesar por el filtro de la placa de cultivo de la hoja de bisturí que utilizó para cortarla. Colocarlo en el filtro tal que el agujero de la hoja de bisturí rodea el centro del filtro. Coloque la placa de cultivo en la etapa de calefacción del microscopio.
5. Carga 3.2 l de su ADN diluido (en este caso plásmidos codifican VSVGts045-GFP control = inyección simulada) en una aguja de microinyección (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), gire la tapa protectora de la aguja y la dejó caer al suelo . Ahora que la aguja está listo para ser atornillada en su soporte. Para hacerlo, pulse la tecla de menú de su InjectMan y asegúrese de que la válvula se cierra. Enrosque la aguja en su soporte, cuidado con el tornillo de la aguja con demasiada fuerza ya que puede conducir a la rotura. A continuación, pulse la tecla de menú de nuevo, la aplicación de P _c evitará que los medios de comunicación de ser succionado por la aguja durante el procedimiento microinjeciton. Por último, pulse el joystick para borrar homing almacenados.
6. Para bajar la aguja en la celdas, utilice el objetivo de 10X y poner la aguja en el haz de luz por encima del líquido. Ahora se centran en las células, poner el foco de nuevo girando la rueda de enfoque 180 º, y encontrar la aguja. A continuación, mueva lentamente la aguja en el foco, a continuación, llevar a cabo de nuevo el enfoque (de trabajo para acercar a las células en el foco de nuevo), bajar la aguja en lacus de nuevo. Repita hasta que la aguja toca la superficie de los medios de comunicación, momento en el que todo lo que vemos es un halo. Al llegar a un punto en el que las células están en el foco, pero la aguja es aún difusa (es decir, fuera del plano focal) cambio en el objetivo de 32X y una multa ajustes gruesos.
7. Establecer el límite z-al tocar la membrana apical con la punta de la aguja y restando alrededor de 10 micras como los núcleos están despidiendo a unos 10 m debajo de la membrana apical.
8. Después de establecer el límite de z, encontrar la presión de inyección derecha. Comenzará a las 95 PSI. Si la presión es demasiado alta, las células va a explotar. Si la presión es demasiado baja, aparecerá un punto blanco que se mantiene, pero no pasa nada. Con una inyección de éxito, usted verá un cambio de fase sin cambiar el tamaño de la celda. Para la inyección, deje la aguja de un par de micrones fuera del plano focal lo más rápido posible. Apunta con la aguja por encima del núcleo (es decir, la mitad de una celda individual) y pulse el botón de inyección de su joystick, pero no mantener el botón presionado.
9. Inyectar 100-500 células dentro del agujero de la hoja de bisturí que se encuentra en las células. Cuando haya terminado, ponga sus células con la placa de cultivo y la hoja de bisturí en una incubadora de 39 ° C, y se incuba durante 2 horas Durante este tiempo, VSVGts045-GFP se expresa y secreta en la sala de emergencias. Sin embargo, a los 39 ° C, VSVGts045-GFP no se pliegan correctamente y por lo tanto no puede salir de la sala de emergencias. Mientras tanto, la pequeña GTPasa de interés se acumula en el citosol en los experimentos de co-inyección.
10. Después de 2 horas, colocar las células en 1 ml de medio de cultivo MEM más HEPES 50 mM y 0,1 cicloheximida mg / ml en una placa de 12 pocillos y se incuba durante 2 horas a 31 ° C. Durante este período de persecución, VSVGts045-GFP se pliegan correctamente, salga de la sala de emergencia y se entrega a la superficie celular.
11. Repita los pasos 3,1 a 3,10 para los filtros de dos (inyectar plásmidos que codifican VSVGts045-GFP y, por ejemplo-V5 etiquetados Rab13T22N) y tres (inyectar plásmidos que codifican VSVGts045-GFP y, por ejemplo-V5 etiquetados Rab13Q67L). Cada inyección de unos 20 - 60 min. Sin embargo, es absolutamente crucial para el tratamiento de todos los filtros de la misma manera a lo largo de la incubación la temperatura de cambio y tinción de la superficie hasta que fijar las células. Después de la fijación, puede realizar el resto de su protocolo de tinción para todos los filtros al mismo tiempo.

4. Tinción de la superficie para el análisis de inmunofluorescencia

Tenga en cuenta, con el fin de evitar el blanqueo de la señal de las buenas prácticas agrarias de VSVGts045-GFP, proteger a los ejemplares de la luz cubriendo con papel de aluminio durante todos los procedimientos posteriores.

1. Si desea realizar la tinción de la superficie, el lugar a las células en una placa de cultivo en una placa de metal en el hielo y lavar las células con 1X PBS enfriado con hielo ^{2 +} (PBS [0,2 g / litro KCl, 0,2 g / litro KH ₂ PO _4, 8 g / l de NaCl y 2,17 g / l de Na ₂ HPO ₄ x 7 H ₂ O], más de 0,1 g / l de CaCl ₂ y 0,1 g / litro de MgCl ₂ x 6 H ₂ O). Posteriormente, el lugar 30 l de un anticuerpo que reconoce el ectodominio de la proteína, en este caso el anticuerpo monoclonal de ratón TK1 (IgG _1, obtenidos a partir de finales de los años Kreis Thomas), en parafina limpia colocada sobre la placa de metal en el hielo. Coloque el filtro con las células de su boca abajo sobre la gota y añadir unas gotas de anticuerpos en la parte posterior del filtro. Incubar durante 1 h sobre hielo.
2. Células de lugar en una placa de 12 pocillos, lavar 3 veces con PBS enfriado con hielo ^{2 +} (o RT PBS caliente ^{2 +} sin manchar la superficie antes), y fijar con paraformaldehído 3% durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Lave las células una vez con PBS ^{2 +} y dejar en PBS ^{2 +} durante 5 min.
4. Se incuban las células en el bloqueo / permeabilización de amortiguación (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] de saponina en PBS ^{2 +)} con un 10% [vol / vol] de suero de cabra. Incubar 1 hora a temperatura ambiente.
5. Diluir anticuerpos primarios para detectar la GTPasa Rab expresado, en este ejemplo anti-V5 (anticuerpo monoclonal de ratón _IgG2a, Invitrogen), 1:200 en el BPB. Giro anticuerpos diluido en una microcentrífuga Eppendorf durante 10 minutos a 13.000 rpm. Colocar 30 ul de la solución de anticuerpos en parafina limpia en una cámara húmeda. Lugar de las células en el filtro al revés sobre la caída de anticuerpos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
6. Vuelva a colocar las células (lado derecho) en una placa de 12 pocillos y lavar 5 veces durante 30 minutos con BPB a temperatura ambiente.
7. Diluir apropiado secundaria de anticuerpos, en este caso de cabra anti-ratón IgG ₁ Alexa 594-etiquetado (por VSVG detección en la superficie, Invitrogen), y Cy5-anticuerpos secundarios marcados para reconocer su GTPasa Rab, en este ejemplo de cabra anti-ratón IgG _2a Cy5-etiquetados (Jackson ImmunoResearch), 1:200 a BPB y el giro que el anterior. Lugar 30 l solución de anticuerpos en parafina limpia en una cámara húmeda y las células de lugar en boca del filtro hacia abajo en la caída de anticuerpos. Incubar 1 hora a temperatura ambiente.
8. Repita el paso 4.6.
9. Sumerja las células en el filtro 3 veces en agua destilada y el lugar rpor lado DERECHO en portaobjetos. Añadir 10-15 l montaje (10% [wt / vol] DABCO, el 50% [wt / vol] de glicerol en agua destilada) en la parte superior de las células. 18x18 mm lugar de vidrio cubierta de micro en la parte superior y el uso de pañuelos de papel y presione suavemente la tapa de vidrio micro a las células. Sello con esmalte de uñas.
10. Analizar las muestras con un microscopio confocal. Se utilizó un Microsystem LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc., que estaba equipado con un lente de 63X de inmersión en agua.
11. Para la preparación de las figuras, ajustar y combinar imágenes con programas como Adobe Photoshop y Adobe Illustrator.

5. Resultados representante

Para ver ejemplos de cómo la co-expresión de proteínas G pequeñas interfiere con VSVG clasificación amablemente se refieren a los artículos publicados, ya sea para missorting apical ^{3, 4} o la inhibición de la entrega de la superficie de ^7.

Figura 1. En la inyección simulada, es decir, una inyección de sólo el plásmido que codifica VSVGts045-GFP, la proteína se entrega a la superficie basolateral de bien polarizado células MDCK a juzgar por la tinción de la superficie (en rojo, la Figura 1 A). Tenga en cuenta que no todos los VSVGts045-GFP se entrega a la membrana basolateral durante la persecución a 31 ° C como se evidencia por la señal intracelular amplia para la proteína total (en verde, las figuras 1 A y B). En las células que no están bien polarizadas VSVGts045-GFP se entregará también a la membrana apical (Figura 1 B). Si sus muestras de control de parecerse a la de células B en la Figura 1, no se puede confiar en sus datos y tener que repetir el experimento con células polarizadas mejor. Las barras de escala es de 5 micras.

Discussion

Los pasos más importantes para un experimento de microinyección éxito son la calidad y pureza del ADN y la polaridad de las células. Sin células polarizadas, el control de la inyección ya se han mistargeted VSVG y el experimento no se puede utilizar. Si el ADN es de mala calidad, el ADN puede obstruir la aguja de inyección que lleva a los pobres o no la expresión de la proteína deseada en absoluto. Además, es aconsejable usar plásmidos de expresión que se sabe que conducen a altos niveles de expresión como pRKV.

Si usted desea poner a prueba para la clasificación de las proteínas de otras cargas, los protocolos de cambio de temperatura se puede modificar. Por ejemplo, para expresar los receptores de baja densidad de lipoproteínas, se realiza la microinyección a 37 ° C seguido de una incubación de 1 hora a 37 ° C, 4 horas a 20 ° C (para detener la carga en el TGN) y 2 horas a 37 ° C en presencia de 0,1 mg / ml de cicloheximida para perseguir a la proteína de la superficie. Para algunas proteínas como los receptores Fc, el tiempo de incubación a 20 ° C puede reducirse a 2 horas depende de la rapidez de su carga de proteínas se sintetizan y se desplaza a través de la vía secretora. Para una descripción detallada de incubación que se utilizó para las proteínas de carga diferentes ver Nokes et al., 2008 ^7.

Finalmente, este protocolo no sólo puede ser utilizado para el análisis de las GTPasas pequeñas, pero en teoría de todas las proteínas o fragmentos de proteínas que usted sospecha que puede tener una función en la prestación de superficie (polarizado).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage	Carl Zeiss, Inc.	Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator	Eppendorf	Custom order
Femtotips II (Microinjection needles)	Eppendorf	930000043
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Clear 12-mm transwell filter supports	Corning	3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit	Sigma-Aldrich	NA0400