Summary
هذه المقالة تفاصيل الإجراءات المتعلقة overexpression وتحليل GTPases صغيرة في الخلايا الظهارية الاستقطاب باستخدام تقنية microinjection.
Abstract
الخلايا الظهارية استقطاب غشاء البلازما الخاصة بهم في كيميائيا ومتميزة وظيفيا المجالات قمية وbasolateral حيث المجال قمية يواجه 'الحرة' السطوح والغشاء basolateral على اتصال مع الركيزة والخلايا المجاورة. ويفصل غشاء كلا المجالات التي منعطفات ضيقة ، والتي تشكل حاجزا نشرها. ويمكن تلخيصها قمية - basolateral بنجاح في ثقافة الاستقطاب عند المصنف الخلايا الظهارية مثل الكلى الناب مدين - داربي (MDCK) في الخلايا على مرشحات عالية الكثافة والبولي ومثقف لعدة أيام 1 2. وينظم إنشاء وصيانة قطبية الخلية من قبل مجموعة من GTPases صغير من الفصيلة مثل رأس رالا ، Cdc42 ، Rab8 ، وRab10 Rab13 3 4 5 6 7. مثل كل GTPases هذه البروتينات دورة الناتج المحلي الإجمالي بين دولة محددة نشط وفعال دولة GTP محدد. طفرات معينة في مناطق الربط النوكليوتيدات تتداخل مع هذه الدراجات 8. على سبيل المثال ، يتم تأمين دائم Rab13T22N في شكل الناتج المحلي الإجمالي ، وبالتالي يطلق عليها اسم "المهيمن السلبية" ، في حين لم تعد قادرة على Rab13Q67L يتحلل GTP ومؤمن وبالتالي في حالة "نشطة المهيمنة' 7. لتحليل وظيفتها في الخلايا عادة يتم التعبير عن كل من الأليلات السائدة السلبية والنشطة GTPases المهيمن على مستويات عالية للتدخل في وظيفة من البروتينات الذاتية 9. طريقة أنيقة لتحقيق مستويات عالية من overexpression في فترة قصيرة من الوقت هي لتعريف البلازميدات ترميز البروتينات ذات الصلة مباشرة في نوى خلايا الاستقطاب نمت على تصفية تدعم استخدام تقنية microinjection. غالبا ما يتم الجمع بين هذا مع الحقن المشترك للالبلازميدات مراسل تكود مستقبلات غشاء البلازما التي يتم فرزها على وجه التحديد إلى المجال أو قمية basolateral. وكثيرا ما تستخدم لشحن البضائع تحليل الفرز إلى المجال basolateral هو أليل درجة الحرارة حساسة من فيروس التهاب الفم الحويصلي بروتين سكري (VSVGts045) 10. لا يمكن لهذا البروتين بشكل صحيح في حظيرة 39 درجة مئوية ، وبالتالي فسيتم الاحتفاظ بها في شبكية هيولي باطني (ER) ، في حين يتم تجميع البروتين التنظيمية للمصلحة في العصارة الخلوية. التحول إلى 31 درجة مئوية وسوف يسمح لأمثال ثم VSVGts045 بشكل صحيح ، وترك لائحة والسفر إلى غشاء البلازما 11. عادة ما يتم تنفيذ هذه المطاردة في حضور سيكلوهيكسيميد لمنع المزيد من تخليق البروتين يؤدي إلى نتائج أكثر نظافة. نحن هنا تصف بالتفصيل إجراءات microinjecting البلازميدات الى خلايا الاستقطاب وحضانات التحولات اللاحقة بما في ذلك درجة الحرارة التي تسمح لتحليل شامل من البروتينات التنظيمية المشاركة في الفرز basolateral.
Protocol
1. عزل DNA البلازميد
- استخدام الذيفان الداخلي خالية سيغما الدريخ maxiprep عدة للتحضير الحمض النووي الذيفان الداخلي مجانا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. هذه المجموعة تعمل من أجلنا ، لأنه يزيل السموم الداخلية من اي موثوق الاستعدادات الحمض النووي. وسوف يتم حقن السموم الداخلية التي مع الحمض النووي في نواة الخلية يؤدي إلى موت الخلية.
- إضافة 100 ميكرولتر الفينول / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) على الحمض النووي معزولة ، وتدور الدوامة ل1 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge إيبندورف. نقل المياه في المرحلة العليا في أنبوب جديد وإضافة 100 كلوروفورم ميكرولتر / isoamylalcohol (24:1) ، وتدور الدوامة على النحو الوارد أعلاه. نقل المياه في المرحلة العليا التي تحتوي على الحمض النووي لأنبوب جديد. هناك حاجة إلى هذه الخطوة لإزالة أي البروتين من الحمض النووي ، مما يمنع انسداد microinjection الإبرة.
- ترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.0) إلى تركيز النهائي من 300 ملم و 2 المجلد العاشر الإيثانول بنسبة 100 ٪. في احتضان -20 درجة مئوية خلال الليل. تدور الحمض النووي لمدة 20 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge إيبندورف ، ويغسل مرة واحدة مع 70 ٪ من الإيثانول ، وresuspend الذيفان الداخلي في 300 ميكرولتر خالية من المياه (سيغما الدريخ).
- تحديد تركيز الحمض النووي. ويتراوح تركيز الحمض النووي النموذجي 1-5 ميكروغرام / ميكرولتر.
2. ثقافة خلايا MDCK
- انقسام الخلايا MDCK. عدد الخلايا والبذور 4 X 10 5 مرشحات واضحة على الخلايا Transwell 12 ملم (0.4 ميكرومتر حجم المسام ، كورنينج Costar ، 3460). عن تجربة وهمية تحتوي على حقن مراقبة واثنين من البروتينات المختلفة راب متحولة البذور تحتاج إلى ثلاث مرشحات.
- خلايا الثقافة MDCK في المتوسط مع MEM 2 مم L - الجلوتامين ، 0.1 ملغ / مل البنسلين / الستربتوميسين و 7 ٪ (المجلد / المجلد) مصل بقري جنيني (= وسائط النمو MEM) في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- تغير وسائل الاعلام في غرفة basolateral كل يوم. هذا يساعد في عملية الاستقطاب ، لأنه يحاكي الوضع من الخلايا الظهارية في الحيوانات.
- 2 أيام بعد البذر تحقق في ما إذا كان المجهر الخلايا تنمو في أحادي الطبقة المغلقة. إذا لم تتمكن من اكتشاف أي ثقوب في أحادي الطبقة ، نفذ تجربتك في اليوم 3. إذا كان لا تزال هناك ثغرات ، نفذ تجربتك في يوم 4.
3. Microinjection الداخلي وحضانات بعد الحقن
- في يوم من التجربة إعداد وسائط النمو 5 مل MEM بالإضافة إلى 50 ملي HEPES في واحد لوحة × 60 مم 15 لكل مرشح والمكان الى 39 درجة مئوية الحاضنة. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأ واحدا جيدا لوحة 12 - جيدا مع وسائل الإعلام 1 مل النمو MEM بالإضافة إلى 50 ملم وHEPES 0.1 ملغ / مل سيكلوهيكسيميد مرشح الواحد ، والمكان الى حاضنة 31 درجة مئوية.
- تشغيل المجهر microinjection الخاص وتعيين مرحلتها ساخنة إلى 39 درجة مئوية. علينا استخدام المجهر المقلوب (Axiovert 200 ، كارل زايس MicroImaging ، وشركة) مع مرحلة ساخنة ، والأهداف 10X 32X ، وFemtojet إيبندورف (Injectman NI2). أخيرا ، فتح خزان غاز النيتروجين الذي يوفر الجدول الهواء مع النيتروجين.
- تخفيف الحمض النووي مع الماء المصفى (الفلتر استخدام 0.2 ميكرومتر) إلى التركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل في الحجم الكلي لل1-10 ميكرولتر. في وقت لاحق ، وتدور في الحمض النووي microcentrifuge إيبندورف في 13000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. إزالة الجزء العلوي وضعها في أنبوب جديد. هذه الخطوة التي تؤمن عند تحميل الحمض النووي الخاص المخفف في إبرة microinjection يمكنك تحميل بدقة "نظيفة" الحمض النووي. الحمض النووي الخاص بك هو الآن على استعداد لmicroinjection.
- تحضير الخلايا الخاصة بك عن طريق اتخاذ خارج التصفية الأولى من صحن ثقافته. مع شفرة جراحية (الريشة بليد الجراحية ، الفولاذ المقاوم للصدأ ، رقم 11) ، قطع المرشح من صاحب تصفية ومكان في 5 مل و 39 درجة مئوية MEM نمو وسائل الإعلام بالإضافة إلى 50 HEPES الدافئة مم (60 × 15 مم لوحة). تثقل المرشح في لوحة الثقافة مع شفرة الجراحية التي تستخدم لقطع بها. وضعه على مثل هذه التصفية التي الحفرة للشفرة جراحية يحيط منتصف التصفية. مكان صحنك الثقافة على الساحة الساخنة في المجهر.
- تحميل 2-3 ميكرولتر من الحمض النووي الخاص المخفف (في هذه الحالة البلازميدات ترميز VSVGts045 GFP - = التحكم الحقن وهمية) في إبرة microinjection (Femtotip الثاني ، إيبندورف ، 930000043) ، وتطور الغطاء الواقي من الإبرة والسماح لها تقع على الأرض . إبرة الآن هو على استعداد ليكون مشدود إلى حامله. للقيام بذلك ، اضغط على مفتاح القائمة من injectman الخاص والتأكد من اغلاق صمام أسفل. المسمار الإبرة في حامله ، حذار ألا المسمار في إبرة محكم جدا والتي قد تؤدي إلى الكسر. الآن ، اضغط على مفتاح القائمة مرة أخرى ، سوف تطبق ف ج منع وسائل الإعلام من الانجرار الى الإبرة أثناء إجراء microinjeciton. أخيرا ، اضغط على عصا التحكم الخاص لمحو صاروخ موجه المخزنة.
- لخفض الإبرة على الخلايا ، استخدم 10X وتحقيق الهدف الإبرة في شعاع ضوء فوق السائل. التركيز الآن على الخلايا ، ليصبح التركيز من جديد من خلال تحويل التركيز العجلة 180 درجة أعلى ، والعثور على الإبرة. بعد ذلك ، تحرك ببطء إبرة في التركيز ، ثم تبرز مرة أخرى للتركيز (العمل من أجل إحلال الخلايا في التركيز مرة أخرى) ، إسقاط الإبرة لسلطات الجمارك مرة أخرى. كرر حتى إبرة تلامس سطح وسائل الإعلام ، وعند هذه النقطة فقط سترى هي هالة. عند الوصول إلى النقطة التي كانت الخلايا في التركيز ، ولكن لا يزال غامض الإبرة (أي الخروج من الطائرة البؤرية) تغيير على الهدف وضبط 32X الخشنة غرامة.
- ض تعيين الحد عن طريق لمس الغشاء القمي مع رأس الإبرة وطرح حوالي 10 ميكرون حيث يتم زرع نواة ما يقرب من 10 ميكرومتر تحت غشاء قمي.
- بعد تعيين الحد - Z ، والعثور على ضغط حقن الحق. تبدأ في 95 PSI. إذا كان ضغط مرتفع جدا ، وسوف خلاياك تفجير. إذا كان ضغط منخفض جدا ، سترى أن يبقى نقطة بيضاء ، لكن لا يحدث أي شيء آخر. مع حقن ناجحة ، سوف نرى تغييرا المرحلة من دون تغيير حجم الخلية. للحقن ، وجلب الإبرة بضعة ميكرونات من الطائرة الاتصال بأسرع وقت ممكن. الهدف مع إبرة فوق النواة (أي منتصف الخلية الفردية) واضغط على زر حقن عصا التحكم الخاصة بك ، ولكن لا الاستمرار على زر أسفل.
- حقن الخلايا 100-500 داخل الثقب الخاص شفرة الجراحية التي تقع على الخلايا الخاصة بك. عند الانتهاء ، ومكان الخلايا مع الطبق الثقافة وشفرة جراحية في الحاضنة 39 درجة مئوية ، واحتضانها لمدة 2 ساعة. خلال هذا الوقت ، أعرب VSVGts045 - GFP ويفرز في لائحة. ومع ذلك ، في 39 درجة مئوية ، ويمكن VSVGts045 - GFP لا أضعاف بشكل صحيح ، وبالتالي لا يمكن أن تترك لائحة. وفي الوقت نفسه ، فإن GTPase صغيرة من الفائدة تتراكم في العصارة الخلوية في المشاركة في الحقن التجارب.
- بعد 2 ساعة ، ومكان الخلايا الخاصة بك وسائل الاعلام في 1 مل نمو زائد 50 MEM HEPES ملي و 0.1 سيكلوهيكسيميد ملغ / مل في صفيحة ال 12 جيدا واحتضان لمدة 2 ساعة عند 31 درجة مئوية. خلال هذه الفترة المطاردة ، وسوف VSVGts045 - GFP أضعاف بشكل صحيح ، وترك لائحة ويتم تسليمها إلى سطح الخلية.
- كرر الخطوات 3،1-3،10 للمرشحات اثنين (حقن البلازميدات ترميز VSVGts045 - GFP وعلى سبيل المثال V5 الموسومة Rab13T22N) وثلاثة (حقن البلازميدات ترميز VSVGts045 - GFP وعلى سبيل المثال V5 الموسومة Rab13Q67L). وسوف تتخذ كل حقنة حوالي 20 -- 60 دقيقة. ومع ذلك ، فمن الأهمية القصوى لمعالجة كل مرشح بنفس الطريقة في جميع أنحاء حضانات تحول درجات الحرارة وتلطيخ السطح حتى يمكنك إصلاح الخلايا. بعد التثبيت ، قد نفذ بقية البروتوكول الخاص تلطيخ لجميع المرشحات في نفس الوقت.
4. تلطيخ السطح لتحليل المناعي
لاحظ ، من أجل تجنب تبييض إشارة GFP من VSVGts045 - GFP ، وحماية العينات من الضوء من خلال تغطية برقائق الألومنيوم خلال جميع الإجراءات اللاحقة.
- إذا كنت ترغب في تنفيذ تلطيخ السطح ، مكان الخلايا الخاصة بك في صحن الثقافة على لوحة معدنية على الجليد وغسل خلايا الخاص 1X مع الثلج الباردة PBS 2 + (PBS [0.2 غرام / لتر بوكل ، 0.2 غرام / لتر KH 2 ص 4 ، 8 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، و2.17 غرام / لتر نا 2 هبو 4 × 7 H 2 O] زائد 0.1 غ / لتر CaCl 2 و 0.1 غرام / لتر MgCl 2 × 6 H 2 O). بعد ذلك ، ضع 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة التي تعترف ectodomain من البروتين الخاص بك ، في هذه الحالة الماوس ريتوكسيماب TK1 (مفتش 1 ، تم الحصول عليها من كريس توماس المتأخر) ، على parafilm نظيفة وضعت على لوحة معدنية على الجليد. ضع فلتر مع خلايا الخاص رأسا على عقب على انخفاض وإضافة بضع قطرات من الأجسام المضادة على مساعدات من التصفية. احتضان لمدة 1 ساعة على الجليد.
- خلايا المكان الى 12 لوحة جيدا ، وغسل 3X مع الثلج الباردة PBS 2 + (RT الدافئة أو برنامج تلفزيوني من دون تلطيخ 2 + سطح السابقة) ، والإصلاح مع بارافورمالدهيد 3 ٪ لمدة 15 دقيقة في RT.
- غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 2 + وترك في برنامج تلفزيوني 2 + لمدة 5 دقائق.
- احتضان خلايا في حجب / العازلة permeabilization (BPB) (2 ٪ [بالوزن / المجلد] جيش صرب البوسنة ، 0.4 ٪ [بالوزن / المجلد] سابونين في برنامج تلفزيوني + 2) مع 10 ٪ [المجلد / المجلد] مصل الماعز. ح 1 في احتضان RT.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية للكشف عن وأعرب GTPase الرب ، في هذا المثال لمكافحة V5 (الماوس ضد وحيد النسيلة مفتش 2A ، Invitrogen) ، 1:200 في BPB. تدور الأجسام المضادة المخفف في microcentrifuge إيبندورف لمدة 10 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة. وضعت 30 ميكرولتر مكان من الحل على الضد parafilm نظيفة في غرفة رطبة. مكان الخلايا على تصفية رأسا على عقب على هبوط الأجسام المضادة واحتضان لمدة 1 ساعة عند RT.
- مكان الخلايا الظهر (الجانب الأيمن تصل) في لوحة 12 - 5X يغسل جيدا وأكثر من 30 دقيقة مع BPB في RT.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة ، في هذه الحالة الماعز المضادة للماوس مفتش 1 اليكسا 594 المسمى (لVSVG الكشف على السطح ، Invitrogen) ، والمسمى Cy5 الأجسام المضادة الثانوية للاعتراف GTPase الخاص الرب ، في هذا المثال الماعز المضادة للمفتش الماوس 2A Cy5 المسمى (جاكسون ImmunoResearch) ، 1:200 في BPB وتدور على النحو الوارد أعلاه. 30 حل مكان على الضد ميكرولتر parafilm النظيفة في حجرة رطبة وخلايا المكان رأسا على عقب على تصفية يسقط على إسقاط الأجسام المضادة. ح 1 في احتضان RT.
- كرر الخطوة 4.6.
- تراجع الخلايا على تصفية 3X في الماء منزوع الأيونات والمكان صight حتى على الجانب microslides. إضافة 10-15 جبل ميكرولتر (10 ٪ [بالوزن / المجلد] DABCO ، 50 ٪ [بالوزن / المجلد] الجلسرين في الماء المقطر) على أعلى الخلايا. مكان 18X18 تغطية الزجاج الصغيرة ملم على رأس واستخدام أنسجة الوجه اضغط برفق زجاج الغطاء الجزئي على الخلايا. ختم بطلاء الأظافر.
- تحليل العينات باستخدام المجهر مبائر. استخدمنا LSM الميكروسيستم 510 ، كارل زايس MicroImaging ، المؤتمر الوطني العراقي الذي كان مجهزا عدسة مياه الغمر 63X.
- لإعداد الأرقام ، وتعديل ودمج الصور باستخدام برامج مثل أدوبي فوتوشوب والمصور أدوبي.
5. ممثل النتائج
للحصول على أمثلة على الكيفية التي شاركت في التعبير عن GTPases صغير يتداخل مع VSVG الفرز يرجى الرجوع إلى المقالات التي نشرت عن قمية missorting إما 3 أو 4 أو تثبيط التسليم سطح 7.
الشكل 1. في الحقن وهمية ، أي حقنة من الترميز فقط البلازميد VSVGts045 - GFP ، يتم تسليم البروتين على سطح basolateral جيدا خلايا الاستقطاب MDCK والحكم عليها من خلال تلطيخ السطح (باللون الأحمر ، الشكل 1 أ). لاحظ أن لا يتم تسليم جميع GFP - VSVGts045 إلى غشاء basolateral أثناء مطاردة في 31 درجة مئوية كما يدل على ذلك إشارة إلى داخل الخلايا واسعة لهذا البروتين الكلي (باللون الأخضر ، الشكلان 1 A و B). وسوف يتم في الخلايا التي ليس على ما يرام الاستقطاب يتم تسليم VSVGts045 - GFP أيضا على غشاء قمي (الشكل 1 ب). إذا عينات التحكم الخاصة بك تبدو الخلية في الشكل 1 باء ، لا يمكن الثقة البيانات الخاصة بك ويكون لتكرار التجربة مع أفضل الاستقطاب الخلايا. أشرطة النطاق هي 5 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لتجربة microinjection الناجحة هي جودة ونقاء من الحمض النووي والتقاطب من الخلايا الخاصة بك. بدون خلايا الاستقطاب ، وسوف تسيطر بالفعل الخاص حقن وmistargeted VSVG ولا يمكن استخدامها لتكون التجربة. إذا كان الحمض النووي هو من نوعية رديئة ، قد دنا تسد إبرة الحقن التي تؤدي إلى ضعف أو عدم التعبير عن البروتين المطلوب على الإطلاق. كذلك ، فإنه من المستحسن استخدام التعبير البلازميدات التي تعرف أن تؤدي إلى مستويات عالية التعبير مثل pRKV.
اذا كنت ترغب في اختبار للفرز الشحنات الأخرى من البروتينات ، يمكن تعديل البروتوكولات تحول درجات الحرارة. على سبيل المثال ، للتعبير عن مستقبلات البروتين الدهني المنخفض الكثافة ، ونحن أداء microinjection عند 37 درجة مئوية تليها الحضانة ح 1 في 37 درجة مئوية ، 4 ساعة عند 20 درجة مئوية (للقبض على البضائع في TGN) و 2 في 37 ساعة درجة مئوية في وجود سيكلوهيكسيميد ملغ / مل من 0.1 إلى مطاردة البروتين إلى السطح. بالنسبة لبعض البروتينات مثل مستقبلات القطعة Fc ، وفترة حضانة في 20 · قد تكون خفضت C إلى 2 ح يعتمد على مدى السرعة التي يتم تصنيعه من البروتين الخاص البضائع وينتقل عن طريق الممر إفرازية. للحصول على وصف مفصل للحضانات التي استخدمناها للبروتينات البضائع المختلفة انظر Nokes وآخرون ، 2008 7.
أخيرا ، لا يمكن إلا أن تستخدم هذا البروتوكول لتحليل GTPases صغيرة ، ولكن من الناحية النظرية لجميع البروتينات أو شظايا البروتين الذي كنت تشك قد يكون له وظيفة في مجال تقديم السطحية (الاستقطاب).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة (GM070736) لحاء Fölsch. كان مدعوما من قبل SF آنغ A STAR * الجائزة منحة دراسية عليا ، وكان مدعوما من قبل RS كانغ أساس الخلوية والجزيئية لبرنامج التدريب على الأمراض (GM8061)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss, Inc. | Custom order | |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order | |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning | 3460 | |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
- Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
- Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
- Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).
- Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
- Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).
- Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).
- Collins, R. N.
- Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).
- Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).
- Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).
