Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Summary

Bu makalede, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak polarize epitel hücreleri küçük GTPases aşırı ekspresyonu ve analiz yer alan usul.

Abstract

Apikal etki 'ücretsiz' yüzeyleri yüzleri ve bazolateral membran substrat ve komşu hücrelerle temas biyokimyasal ve fonksiyonel olarak farklı apikal ve bazolateral etki alanı içine plazma zarı kutuplaştırırlar epitel hücreleri. Her iki membran etki, bir difüzyon bariyeri oluşturan sıkı bağlantıları ayrılır. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücreleri, epitel hücreleri polikarbonat filtreler yüksek yoğunluklu numaralı seribaşı ve birkaç gün ^{1 2} kültüre Apikal-bazolateral kutuplaşma kültürü başarıyla değinmeyecek. Ras süperailesinin RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 ve Rab13 ^{3 4 5 6 7} gibi küçük GTPases bir dizi hücre polarite kurulması ve bakımı tarafından düzenlenir. GDP-bağlı etkin olmayan bir devlet ve aktif bir GTP bağlı devlet arasındaki tüm GTPases gibi bu proteinlerin döngüsü. Bu bisiklet ⁸ ile nükleotid bağlayıcı bölgelerinde spesifik mutasyonların etkileyebilir. Örneğin, Rab13T22N kalıcı GSYİH-form kilitlenir ve böylece 'olumsuz baskın' olarak adlandırılan, Rab13Q67L artık GTP hidroliz ise ve bu nedenle bir 'baskın aktif' ^devlet 7 kilitlenmiş durumda . Hücreleri, kendi işlevlerini analiz etmek GTPases iki baskın baskın negatif ve aktif allel genellikle endojen proteinlerin ⁹ fonksiyonu ile müdahale yüksek seviyelerde ifade edilir. Kısa bir miktarı aşırı ekspresyonu yüksek düzeylerine ulaşmak için zarif bir şekilde, filtre, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak destekler yetişen polarize hücrelerinin çekirdekleri doğrudan ilgili proteinleri kodlayan plazmid tanıtmaktır. Bu çoğu zaman özellikle apikal veya bazolateral etki alanı sıralanır plazma membran reseptörleri kodlayan plazmid muhabiri ko-enjeksiyon ile birleştirilmiştir. Bazolateral etki sıralama kargo analiz etmek için sık sık kullanılan bir kargo veziküler stomatit virüsü glikoprotein ^(VSVGts045) 10 ısıya duyarlı bir allel . Bu protein, 39 ° C'de düzgün bir şekilde katlayın ve ilgi düzenleyici protein sitoplazmada monte edilir ve böylece endoplazmik retikulum (ER) muhafaza edilecektir. Bir kayma ile 31 ° C VSVGts045 plazma zarı ¹¹ ER ve seyahat düzgün kat terk etmeye izin verecek. Bu kovalamaca genellikle temiz sonuçları neden daha fazla protein sentezini önlemek için Siklohekzimidsiz varlığı yapılır. Burada detaylı olarak, kapsamlı bir analiz bazolateral sıralama yer alan düzenleyici proteinlerin izin sıcaklık vardiya de dahil olmak üzere polarize hücreler ve sonraki inkubasyon plazmid microinjecting prosedürü açıklar.

Protocol

1. Plazmid DNA İzolasyonu

1. Üreticinin protokole göre endotoksin DNA hazırlamak için Sigma-Aldrich endotoksin maxiprep kiti kullanın. Bu kit, güvenilir bir şekilde herhangi bir DNA hazırlıkları endotoksin kaldırır, çünkü bizim için çalışır. DNA hücre çekirdeklerinin içine enjekte edilir endotoksin, hücre ölümüne yol açacaktır.
2. Izole edilmiş DNA, girdap ve bir Eppendorf mikrosantrifüj 13.000 devirde 1 dakika için spin ul 100 fenol / chlorofom / izoamilalkol (25:24:1) ekleyin. Suyun üst faz yeni bir tüpe transfer ve 100 ul kloroform / izoamilalkol (24:1), yukarıdaki gibi vorteks ve spin ekleyin. DNA içeren yeni bir tüpe suyun üst faz transfer. Bu adım, mikroenjeksiyon iğne tıkanmasını önler DNA, herhangi bir protein kaldırmak için gereklidir.
3. Na asetat (pH 6.0) eklenerek nihai konsantrasyonu 300 mM ve 2 X vol% 100 etanol DNA çöktürün. Gecede -20 ° C'de inkübe edin. Eppendorf mikrosantrifüj 13.000 rpm'de 20 dakika için DNA Spin,% 70 etanol ile bir kez yıkayın ve 300 ul endotoksin ücretsiz su (Sigma-Aldrich) tekrar süspansiyon haline getirin.
4. DNA konsantrasyonu belirleyin. Tipik bir DNA konsantrasyonu, 1 ila 5 mg / ml arasında değişmektedir.

2. MDCK Hücreler Kültür

1. Split MDCK hücreleri. Net 12 mm transwell filtreleri (0.4 mikron gözenek boyutu, Corning Costar, 3460) üzerine X 10 ⁵ hücre hücre ve tohum 4 Sayımı. Mock-enjeksiyon kontrolü ve üç filtreler tohum gereken iki farklı mutant Rab proteinleri içeren bir deneme için.
2. 2 mM L-glutamin, 37 az 0.1 mg / ml penisilin / streptomisin ve% 7 (hacim / hacim) fetal sığır serumu (= MEM büyüme ortamı) ° C ve% 5 CO ₂ ile MEM orta Kültür MDCK hücreleri
3. Her gün bazolateral odasında ortam değiştirin. Hayvanlarda epitel hücrelerinin durumu taklit eder, çünkü bu kutuplaşma sürecinde yardımcı olur.
4. 2 gün kapalı bir tek tabakalı hücrelerin büyüyen olup olmadığını mikroskop tohumlama sonrası kontrol. Tek tabaka herhangi bir delik tespit edemiyorsanız, 3. günde deney gerçekleştirmek. Delikleri hala varsa, günde 4 deneyi gerçekleştirmek.

3. Mikroenjeksiyon Usul ve Post-enjeksiyon inkübatörü

1. Deney günü 39 ° C inkübatör içine 5 ml MEM büyüme ortamı artı her filtre ve yer için bir 60 x 15 mm plakası 50 mM HEPES hazırlar. Buna ek olarak, 1 ml MEM büyüme medya artı 50 mM HEPES ve 0.1 mg / ml Siklohekzimidsiz başına filtresi ve 31 ° C inkübatör içine yer 12 plaka iyi biri.
2. Mikroenjeksiyon mikroskop açın ve 39 ısıtmalı sahne ° C Isıtılmış bir sahne ile inverted mikroskop (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.), 10X ve 32X hedefleri ve Eppendorf FemtoJet (InjectMan NI2) kullanın. Son olarak, nitrojen ile hava masa malzemeleri nitrojen gazı tankının açın.
3. 100 ul - 10 toplam hacmi 0.2 mg / ml bir final konsantrasyon filtrelenmiş su (0.2 mikron filtre kullanın) ile DNA seyreltilir. Daha sonra, 30 dakika 13.000 rpm'de Eppendorf mikrosantrifüj DNA döndürün. Yeni bir tüp içinde üst kısmında yer ve çıkarın. Bu adım, mikroenjeksiyon iğne içine seyreltilmiş DNA yüklediğinizde doğru "temiz" DNA yükleyebilirsiniz sigortalanır. DNA şimdi mikroenjeksiyon için hazırdır.
4. Kültürü yemeğin ilk filtre yaptırmayı hücreleri hazırlayın. Bir cerrahi bıçağı (Feather Cerrahi Bıçak, paslanmaz çelik, No 11), 5 ml, 39 ° C sıcak MEM büyüme ortamı artı 50 mM HEPES (60 x 15 mm plaka) içine filtre filtre tutucu ve yerden kesilmiş. Kültür plaka filtre aşağı kesmek için kullanılan cerrahi bıçak ile tartılır. Cerrahi bıçak delik filtre ortasında çevreleyen, filtre gibi yerleştirin. Mikroskobun ısıtılmış sahneye kültür plakasına yerleştirin.
5. Mikroenjeksiyon iğnesi (Femtotip II, Eppendorf, 930.000.043) içine seyreltilmiş DNA (Bu durumda plazmid kodlama VSVGts045-GFP = sahte enjeksiyon kontrolü) 2-3 ul Yük, iğnenin koruyucu kapağını büküm ve yere düşürdüm . Şimdi iğne onun sahibinin vidalanan hazır. Bunu yapmak için, sizin InjectMan menü tuşuna basın ve vana kapatıldı olduğundan emin olun. Vida, iğne yuvasına doğru kırılmaya neden olabileceğinden çok sıkı iğne vida sakının. Şimdi, tekrar menü tuşuna basın, uygulanan P _c microinjeciton işlemi sırasında iğne içine çekilmesine engel medya önleyecektir. Son olarak, saklanan homing silmek için joystick'e dokunun.
6. Hücreleri üzerine iğne düşürmek için, 10X objektif kullanımı ve sıvı üzerindeki ışık demeti içine iğne getirmek. Şimdi hücreler, yine odak odak tekerleği 180 dönüm ° getirmek odaklama ve iğne bulmak. Daha sonra, yavaş yavaş (hücrelerin yeniden odak noktası haline getirmeye yönelik çalışma) odak tekrar ortaya çıkarmak, sonra odak noktası haline iğne taşımak için, içine iğne aşağı getirmektekrar cus. Iğne medya yüzeyine temas edene kadar tekrarlayın göreceksiniz, bu noktada bir hale. Hücreleri odakta olduğu bir noktaya ulaşabilir, ama iğne (odak düzlemli yani) 32X objektif ve ince kaba ayarları değiştirmek hala bulanık.
7. Apikal membran iğne ucu ile dokunarak ve yaklaşık olarak 10 mikron çekirdekleri çıkartılarak apikal membran altındaki yaklaşık 10 mm döşeme z-limit ayarlayın.
8. Z-limit ayarladıktan sonra, sağ enjeksiyon basıncı bulabilirsiniz. 95 PSI başlayın. Basıncı çok yüksek ise, hücre darbe olacaktır. Basıncı çok düşükse, kalan bir beyaz nokta göreceksiniz, ama başka hiçbir şey olmuyor. Başarılı bir enjeksiyon ile, bir hücre boyutu değişiklik olmadan bir faz değişimi göreceksiniz. Enjeksiyon için, mümkün olduğunca hızlı odak düzlemli iğne birkaç mikron çıkarmak. Çekirdeğin üzerinde iğne (yani bireysel bir hücrenin ortasında) ve joystick enjeksiyon düğmesine basın Amaç, ama düğmesini basılı tutmayın.
9. Hücreleri üzerinde yatıyor cerrahi bıçak delik içinde 100-500 hücreleri enjekte edilir. İşiniz bittiğinde, 2 saat için 39 ° C inkübatör içine kültür çanağı ve cerrahi bıçak ve inkübe hücrelerin Bu süre zarfında, VSVGts045-GFP ifade edilir ve ER salınır. Ancak, 39 ° C, VSVGts045 GFP doğru katlayın edemez ve böylece ER terk edemez. Bu arada, faiz küçük GTPaz ko-enjeksiyon deneyleri sitoplazmada birikir.
10. 31 ° C'de 2 saat, 2 saat sonra, 12 plaka ve inkübe 1 ml MEM büyüme ortamı artı 50 mM HEPES ve 0.1 mg / ml Siklohekzimidsiz içine hücreleri yerde Bu kovalamaca dönemde, VSVGts045-GFP, doğru katlayın ER bırakın ve hücre yüzeyine teslim edilir.
11. (Plazmid kodlama VSVGts045-GFP enjekte örneğin Rab13Q67L V5-etiketli) filtreleri iki (plazmid kodlama VSVGts045-GFP enjekte örneğin Rab13T22N V5-etiketli) ve üç adımları 3.1 - 3.10 tekrarlayın. Her enjeksiyondan yaklaşık 20 - 60 dakika sürecektir. Bununla birlikte, hücrelerin düzeltmek kadar bu sıcaklık değişimi inkubasyon ve yüzey boyama boyunca her filtre aynı şekilde tedavi etmek için kesinlikle çok önemlidir. Fiksasyon sonra, boyama protokol aynı zamanda tüm filtreler geri kalanı yapabilir.

4. Yüzey Boyama İmmünofloresan Analizi

Not VSVGts045-GFP, GFP sinyali beyazlatma önlemek için, sonraki tüm işlemleri sırasında alüminyum folyo ile kaplayarak ışığı örneklerin korumak.

1. Yüzey boyama yapmak istiyorsanız, buz üzerinde metal bir plaka üzerine bir kültür çanak hücrelerinin yeri ve buz PBS ^{2 +} (PBS [0,2 g / L KCl, 0.2 g / L KH ₂ PO ₄ ile 1X hücreleri yıkayın 8 g / L NaCl ve 2.17 g / L Na ₂ HPO ₄ x 7 H ₂ O] artı 0.1 g / L CaCl ₂ ve 0,1 g / L MgCl ₂ x 6 H ₂ O). Daha sonra, yer, bu durumda protein ectodomain tanıyan bir antikor 30 ul fare monoklonal antikor TK1 (IgG _1, geç Thomas Kreis elde edilen), buz üzerinde metal plaka üzerine yerleştirilir temiz parafilm üzerine. Hücreleri ile filtre baş aşağı düşüş üzerine yerleştirin ve arka filtre üzerine antikor birkaç damla damlatılır. 1 saat buz üzerinde inkübe edin.
2. 12 plaka içine yerleştirin hücreleri, 3X buz PBS ² ile yıkama ⁺ (veya RT sıcak PBS ^{2 +} önceki yüzeyi boyama hariç) ve RT 15 dakika için% 3 paraformaldehid ile düzeltmek.
3. PBS ^{2 +} ile bir kez hücreleri yıkayın ve PBS ^{2 +} 5 dakika bekletin.
4. / Permeabilization tampon (BPB) (% 2 [ağırlık / hacim] BSA,% 0.4 [wt / vol] PBS ² saponin ^+)% 10 hacim / hacim] keçi serumu engelleme hücreleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
5. Bu örnekte BPB'deki anti-V5 (fare monoklonal antikor IgG _2a, Invitrogen), 1:200, ifade Rab GTPaz algılamak için primer antikor sulandırınız. 13.000 rpm'de 10 dakika için bir Eppendorf mikrosantrifüj seyreltilmiş antikorlar dönerler. Yeri 30 ul temiz parafilm antikor çözüm ıslak bir odasına yerleştirdi. Filtre hücreleri antikor düşüşü üzerine baş aşağı yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
6. 12 plaka ve 5X RT BPB ile 30 dakika boyunca yıkayın geri yerleştirin hücreleri (sağ tarafında yukarı).
7. Bu durumda, keçi anti-fare IgG ₁ Alexa (yüzeyinde tespiti VSVG için, Invitrogen) 594 etiketli ve Cy5 etiketli sekonder antikor Bu örnekte keçi, Rab GTPaz tanımak için anti-fare IgG _2a, uygun ikincil antikorlar sulandırınız BPB içine 1:200, (Jackson ImmunoResearch) Cy5, etiketli ve yukarıdaki gibi döndürün. Filtre baş aşağı antikor düşüşü üzerine ıslak bir oda ve yer hücreleri temiz parafilm üzerine koyun 30 ul antikor çözüm. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
8. 4.6 adımı tekrarlayın.
9. Deiyonize su ve yer r içine 3X filtre Dip hücreleriLamlar üzerine ight yüzü yukarı. 10-15 ul montaj (% 10 distile su [wt / vol] DABCO,% 50 ağırlık / hacim] gliserol) hücrelerin üstüne ekleyin. Üst ve kutu mendil kullanarak yerleştirin 18x18 mm mikro cam kapak hücreleri hafifçe üzerine mikro cam kapak tuşuna basın. Seal ile oje.
10. Konfokal bir mikroskop ile örneklerin analiz edin. Biz 63X suya daldırma lens ile donatılmış bir Microsystems'ın EKK 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc. Kullandı.
11. Rakamlar hazırlanması için, ayarlamak ve Adobe Photoshop ve Adobe Illustrator gibi programları kullanarak görüntüleri birleştirmek.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Küçük GTPases eş ifade sıralama VSVG müdahale nasıl örnekler için nazik apikal missorting ^{3, 4} veya ⁷ yüzey teslim inhibisyonu ya da yayınlanan makalelere bakın.

Şekil 1. Mock-enjeksiyon, yüzey boyama (kırmızı, Şekil 1 A) tarafından değerlendirilecek gibi, sadece plazmid kodlama VSVGts045 GFP bir enjeksiyon, yani protein iyi polarize MDCK hücreleri bazolateral yüzeyinde teslim edilir. Tüm VSVGts045-GFP 31, kovalamaca sırasında bazolateral membran teslim olduğunu ° C gibi geniş total protein, hücre içi sinyal kanıtladığı (yeşil, 1 A ve B Rakamlar). Iyi polarize değildir hücrelerinde VSVGts045-GFP apikal membran (Şekil 1 B) teslim edilecektir. Kontrol örnekleri Şekil 1 B hücre gibi bakarsanız, size güven ve iyi polarize hücreler ile deneme tekrarlamak zorunda değildir. Ölçeği çubuklar 5 mikron.

Discussion

, Başarılı bir mikroenjeksiyon deney için en kritik adımlar hücrelerinin DNA ve polarite kalite ve saflık. Polarize hücreler olmadan, enjeksiyon kontrolü zaten VSVG mistargeted olacak ve deney kullanılamaz. DNA kalitesiz ise, DNA yoksullara açan bir iğne ya da istenilen protein hiçbir ifade tıkayabilir. Ayrıca, böyle pRKV gibi yüksek ekspresyon düzeyleri yol açtığı bilinen ifade plazmid kullanmak için tavsiye edilir.

Diğer kargo proteinler sıralamak için test etmek isterseniz, sıcaklık değişimi protokolleri değiştirilmiş olabilir. Örneğin, düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörleri ifade etmek için, biz 37 mikroenjeksiyon gerçekleştirmek ° 37 1 saat inkübasyondan takip ° C 4 saat, 20 ° C (TGN kargo tutuklama) ve 37 az 2 saat ° C 0.1 mg / ml Siklohekzimidsiz varlığı yüzey proteini kovalamak için. Fc reseptörleri gibi bazı proteinlerin, inkübasyon süresi 20 ° C, ne kadar hızlı kargo protein sentezlenmiş 2 saat bağımlı indirdi olabilir ve sekretuar yolu dolaşır. Farklı kargo proteinler için kullanılan inkubasyon ayrıntılı bir açıklama, 2008 ⁷ Nokes ve ark. Görüyoruz.

Son olarak, bu protokol küçük GTPases analizi için sadece kullanılan olabilir, ama şüphelendiğiniz tüm protein veya protein parçaları için teori (polarize) yüzey teslim bir işleve sahip olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage	Carl Zeiss, Inc.	Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator	Eppendorf	Custom order
Femtotips II (Microinjection needles)	Eppendorf	930000043
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Clear 12-mm transwell filter supports	Corning	3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit	Sigma-Aldrich	NA0400