Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren in Überexpression und Analyse von kleinen GTPasen in polarisierten Epithelzellen mit Mikroinjektionstechnik beteiligt.

Abstract

Epithelzellen polarisieren ihrer Plasmamembran in biochemisch und funktionell unterschiedliche apikalen und basolateralen Bereichen, in denen die apikale Domäne Gesichter der "freien" Flächen und der basolateralen Membran in Kontakt mit dem Substrat und den benachbarten Zellen. Sowohl Membran-Domänen sind durch Tight Junctions, die eine Diffusionsbarriere Form getrennt. Apical-basolateralen Polarisation kann erfolgreich in Kultur rekapituliert werden, wenn Epithelzellen wie Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen in hoher Dichte auf Polycarbonat-Filtern ausgesät und kultiviert für mehrere Tage ^{1 2.} Aufbau und Pflege von Zellpolarität ist durch eine Reihe von kleinen GTPasen der Ras-Superfamilie wie Rala, Cdc42, Rab8, RAB10 und Rab13 ^{3 4 5 6 7} geregelt. Wie alle GTPasen diese Proteine ​​Zyklus zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen Zustand und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand. Spezifische Mutationen in der Nukleotid-bindenden Regionen stören mit diesem Rad ^8. Zum Beispiel ist Rab13T22N dauerhaft in der GDP-Form gesperrt und damit Beinamen "dominant negative", während Rab13Q67L nicht mehr hydrolysieren können GTP und ist somit in eine "beherrschende active 'Zustand ⁷ gesperrt. Zur Analyse ihrer Funktion in Zellen sowohl dominant negative und dominant aktiven Allele GTPasen sind in der Regel auf einem hohen Niveau zum Ausdruck gebracht, mit der Funktion der körpereigenen Proteinen ⁹ eingreifen. Eine elegante Methode zur hohen Überexpression in kürzester Zeit zu erreichen, ist die Plasmide der entsprechenden Proteine ​​direkt in den Kernen der polarisierten Zellen auf Filterpapier unterstützt die Verwendung von Mikroinjektionstechnik gewachsen einzuführen. Dies ist oft mit dem Co-Injektion von Reporter-Plasmide, die Plasmamembran-Rezeptoren, die speziell auf die apikalen oder basolateralen Domäne sortiert kodieren kombiniert. Eine Ladung häufig verwendet, um Fracht zu analysieren Sortierung der basolateralen Domäne ist eine temperaturempfindliche Allel des vesikulären Stomatitis Virus Glycoprotein (VSVGts045) ^10. Dieses Protein kann nicht richtig falten bei 39 ° C und wird somit in das endoplasmatische Retikulum (ER) zurückgehalten werden, während das regulatorische Protein von Interesse im Cytosol zusammengebaut wird. Eine Verschiebung um 31 ° C lassen sich dann VSVGts045 richtig falten, verlassen das ER und Reisen in die Plasmamembran ^11. Diese Jagd ist in der Regel in Gegenwart von Cycloheximid durchgeführt, um weitere Proteinsynthese, was zu saubereren Ergebnisse zu verhindern. Hier haben wir im Detail beschreiben das Verfahren der Mikroinjektion Plasmide in polarisierten Zellen und anschließender Inkubation wie Temperatur verschiebt sich, dass eine umfassende Analyse von regulatorischen Proteinen in basolateralen Sortierung beteiligt zu ermöglichen.

Protocol

1. Isolierung von Plasmid-DNA

1. Verwenden Sie einen Sigma-Aldrich Endotoxin-freie Maxiprep Kit Endotoxin freie DNA nach dem Protokoll des Herstellers vorzubereiten. Dieses Kit arbeitet für uns, denn es entfernt zuverlässig alle Endotoxinen aus DNA-Präparationen. Endotoxine, die mit der DNA in den Zellkern gespritzt wird zum Zelltod führen.
2. 100 l Phenol / chlorofom / Isoamylalkohol (25:24:1), um die isolierten DNA-, Vortex-und Spin für 1 min bei 13.000 rpm in einer Eppendorf Mikrozentrifuge. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen und 100 ul Chloroform / Isoamylalkohol (24:1), Vortex-und Spin wie oben. Übertragen Sie die obere wässrige Phase mit der DNA in ein neues Röhrchen. Dieser Schritt ist notwendig, um ein Protein aus der DNA, die aus der Mikroinjektion Verstopfen der Nadel verhindert zu entfernen.
3. Fällung der DNA durch Zugabe von Na-Acetat (pH 6,0) auf eine Endkonzentration von 300 mm und 2 x Vol. 100% Ethanol. Inkubation bei -20 ° C über Nacht. Spin DNA für 20 min bei 13.000 rpm in einer Eppendorf Mikrozentrifuge, einmal waschen mit 70% Ethanol und resuspendieren in 300 ul Endotoxin-freiem Wasser (Sigma-Aldrich).
4. Bestimmen DNA-Konzentration. Ein typisches DNA-Konzentration reicht von 1 bis 5 ug / ul.

2. Kultur von MDCK-Zellen

1. Split MDCK-Zellen. Zählen von Zellen und Saatgut 4 X 10 ⁵ Zellen auf klare 12-mm Transwell-Filter (0,4 um Porengröße, Corning Costar, 3460). Für ein Experiment mit einem Mock-Einspritz-und zwei verschiedene mutierte Rab-Proteine ​​müssen Sie Samen drei Filter.
2. Kultur MDCK-Zellen in MEM-Medium mit 2 mM L-Glutamin, 0,1 mg / ml Penicillin / Streptomycin und 7% (vol / vol) fötales Rinderserum (= MEM Nährmedien) bei 37 ° C und 5% CO _2.
3. Ändern Medien in der basolateralen Kammer jeden Tag. Dies hilft bei der Polarisation Prozess, weil es die Situation der Epithelzellen in Tiere nachahmt.
4. 2 Tage post-Seeding überprüfen in einem Mikroskop, ob die Zellen werden in einer geschlossenen Monolage wachsen. Wenn Sie nicht erkennen kann keine Löcher in die Monoschicht, führen Sie das Experiment an Tag 3. Wenn es noch Löcher, führen das Experiment an Tag 4.

3. Mikroinjektion Verfahren und Post-Injektion Inkubationen

1. Am Tag der Vorbereitung des Experiments 5 ml MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES in einer 60 x 15 mm-Platte für jeden Filter und in einen 39 ° C Inkubator. Darüber hinaus, bis eine Vertiefung einer 12-well-Platte mit 1 ml MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES und 0,1 mg / ml Cycloheximid pro Filter, und in einen 31 ° C Inkubator gesetzt.
2. Schalten Sie Ihren Mikroinjektion Mikroskop und setzen Sie den Heiztisch bis 39 ° C. Wir verwenden ein inverses Mikroskop (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) mit einer beheizten Bühne, 10X und 32X Ziele und ein Eppendorf FemtoJet (InjectMan NI2). Schließlich, öffnen Sie das Stickstoff-Gas-Tank, der Luft-Tabelle liefert mit Stickstoff.
3. Verdünnen DNA mit gefiltertem Wasser (benutzen 0,2 um-Filter), um eine endgültige Konzentration von 0,2 mg / ml in einem Gesamtvolumen von 10 bis 100 ul. Anschließend Spin DNA in Eppendorf Mikrozentrifuge bei 13.000 rpm für 30 min. Entfernen oberen Teil und in einen neuen Schlauch. Dieser Schritt stellt sicher, dass, wenn Sie Ihre verdünnt DNA Last in die Mikroinjektionsnadel können Sie genau load "clean" DNA. Ihre DNA ist nun bereit für die Mikroinjektion.
4. Bereiten Sie Ihre Zellen, indem sie den ersten Filter aus der Kulturschale. Mit einem Skalpell (Feather Surgical Blade, Edelstahl, Nr. 11), den Filter aus dem Filterhalter und Ort geschnitten in 5 ml, 39 ° C warmen MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES (60 x 15 mm-Platte). Beschweren sie die Filter in der Kulturschale mit dem chirurgischen Messer zum Schneiden Sie es aus verwendet werden. Legen Sie es auf dem Filter, so dass die Bohrung des Skalpells der Mitte des Filters umgibt. Zeigen Sie mit der Kultur Platte auf die beheizte des Mikroskops.
5. Legen Sie 2-3 ul der verdünnten DNA (in diesem Fall Plasmiden VSVGts045-GFP = mock Injektion control) in eine Mikroinjektionsnadel (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), drehen Sie die Schutzkappe von der Nadel und ließ ihn auf den Boden fallen . Nun die Nadel ist bereit, in die Halterung geschraubt werden. Dazu drücken Sie die Menü-Taste Ihrer InjectMan und vergewissern Sie sich das Ventil abgeschaltet ist. Schrauben Sie die Nadel in die Halterung, Vorsicht, nicht in die Nadel zu fest Schraube, die zum Bruch führen kann. Nun drücken Sie die Menü-Taste erneut, wird die angelegte P _c die Medien nicht in die Nadel während der microinjeciton Verfahren gesaugt zu verhindern. Schließlich, tippen Sie auf den Joystick, um gespeicherte Homing löschen.
6. Zum Absenken der Nadel auf die Zellen, die 10X-Objektiv und bringen Sie die Nadel in den Lichtstrahl über der Flüssigkeit. Jetzt konzentrieren sich auf die Zellen, bringen den Fokus wieder auf, indem der Fokus Rad um 180 ° auf, und finden Sie die Nadel. Anschließend langsam Nadel in den Fokus, dann bringen unscharf wieder (hinzuarbeiten bringen die Zellen in den Fokus wieder), bringen Nadel in fürKunden wieder. Wiederholen, bis die Nadel berührt die Oberfläche der Medien, an welcher Stelle alles, was Sie sehen, ist ein Heiligenschein. Wenn Sie einen Punkt, an dem die Zellen im Fokus zu erreichen, aber die Nadel ist noch unklar (dh aus der Brennebene) Änderung des 32X objektive und fein grob Einstellungen.
7. Stellen Sie die z-Grenze durch Berühren der apikalen Membran mit der Spitze der Nadel und Subtrahieren etwa 10 um die Kerne sind über ca. 10 pm unterhalb der apikalen Membran.
8. Nachdem Sie die z-Limit setzen, finden Sie den richtigen Einspritzdruck. Start bei 95 PSI. Wenn der Druck zu hoch ist, werden Ihre Zellen die Luft zu sprengen. Wenn Ihr Druck zu niedrig ist, werden Sie sehen, ein weißer Punkt, dass Aufenthalte, aber sonst nichts passiert. Mit einer erfolgreichen Injektion, sehen Sie einen Phasenwechsel ohne eine Zelle zu ändern. Für die Injektion, bringen Sie die Nadel ein paar Mikrometer aus der Bildebene so schnell wie möglich. Zielen Sie mit der Nadel über dem Zellkern (dh der Mitte einer einzelnen Zelle) und drücken Sie die Injektion Button Ihres Joystick, aber nicht die Taste gedrückt halten.
9. Inject 100-500 Zellen in das Loch des Skalpells, die auf Ihrem Zellen liegt. Wenn Sie fertig sind, legen Sie Ihre Zellen mit der Kulturschale und chirurgische Klinge in einem 39 ° C Inkubator, und inkubieren für 2 h. Während dieser Zeit ist VSVGts045-GFP exprimiert und sezerniert in das ER. Doch bei 39 ° C, kann VSVGts045-GFP nicht korrekt zu falten und kann somit nicht aus dem ER. In der Zwischenzeit wird die kleine GTPase von Interesse im Cytosol in Co-Injektion Experimente zu sammeln.
10. Nach 2 h, platzieren Sie Ihre Zellen in 1 ml MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES und 0,1 mg / ml Cycloheximid in einer 12-Well-Platte und Inkubation für 2 h bei 31 ° C. Während dieser Jagd Zeitraum wird VSVGts045-GFP korrekt zu falten, lassen Sie das ER und wird an die Zelloberfläche geliefert.
11. Wiederholen Sie die Schritte 3,1 bis 3,10 für Filter zwei (injizieren Plasmiden VSVGts045-GFP und zum Beispiel Rab13T22N V5-Tag) und drei (injizieren Plasmiden VSVGts045-GFP und zum Beispiel Rab13Q67L V5-Tag). Jede Injektion wird etwa 20 nehmen - 60 min. Allerdings ist es absolut entscheidend, um alle Filter die gleiche Weise in der gesamten Temperatur-Shift Inkubationen und Oberflächenbeschmutzung behandeln, bis Sie die Zellen zu fixieren. Nach der Fixierung, können Sie durchführen den Rest Ihres Färbeprotokoll für alle Filter gleichzeitig.

4. Oberflächenbeschmutzung für Immunfluoreszenz-Analyse

Beachten Sie, um zu vermeiden, Ausbleichen der GFP-Signal von VSVGts045-GFP, zum Schutz der Proben vor Licht durch Abdecken mit Alufolie bei allen nachfolgenden Verfahren.

1. Wenn Sie Oberflächenbeschmutzung durchführen möchten, platzieren Sie Ihre Zellen in einer Kulturschale auf eine Metallplatte auf dem Eis und waschen Sie Ihre Zellen 1x mit eiskaltem PBS ^{2 +} (PBS [0,2 g / l KCl, 0,2 g / l KH ₂ PO _4, 8 g / l NaCl und 2,17 g / l Na ₂ HPO ₄ x 7 H ₂ O] plus 0,1 g / l CaCl ₂ und 0,1 g / l MgCl ₂ x 6 H ₂ O). Anschließend werden 30 ul eines Antikörpers, der Ektodomäne des Protein erkennt, in diesem Fall die monoklonalen Maus-Antikörper TK1 (IgG _1, erhalten aus dem späten Thomas Kreis), auf saubere Parafilm auf die Metallplatte auf Eis gelegt. Setzen Sie den Filter mit Ihren Zellen kopfüber auf dem Tropfen und ein paar Tropfen von Antikörpern auf die Rückseite des Filters. Inkubation für 1 h auf Eis.
2. Legen Sie Zellen in einer 12-Well-Platte 3x mit eiskaltem PBS ^{2 +} (oder RT warmen PBS ^{2 +} ohne vorherige Oberfläche Färbung) und fix mit 3% Paraformaldehyd für 15 min bei RT.
3. Wash Zellen einmal mit PBS ^{2 +} und verlassen in PBS ^{2 +} für 5 min.
4. Inkubieren Zellen zu blockieren / Permeabilisierung Puffer (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] Saponin in PBS ^{2 +)} mit 10% [v / v] Ziegenserum. Inkubieren 1 h bei RT.
5. Verdünnen primären Antikörper gegen das ausgedrückt Rab GTPase erkennen, in diesem Beispiel anti-V5 (monoklonalen Maus-Antikörper IgG _2a, Invitrogen), 1:200 in BPB. Spin verdünnt Antikörper in einer Eppendorf Mikrozentrifuge für 10 min bei 13.000 Umdrehungen pro Minute. Platz 30 ul der Antikörper-Lösung auf saubere Parafilm in eine feuchte Kammer. Legen Sie die Zellen auf Filterpapier kopfüber auf den Antikörper drop und Inkubation für 1 h bei RT.
6. Legen Zellen zurück (rechts oben) in einer 12-Well-Platte und waschen mehr als 30 min mit BPB bei RT 5X.
7. Verdünnen entsprechenden Sekundärantikörper, in diesem Fall Ziege anti-Maus IgG ₁ Alexa 594-markierten (für VSVG Erkennung auf der Oberfläche, Invitrogen) und Cy5-markierten Sekundärantikörper Ihre Rab GTPase zu erkennen, in diesem Beispiel Ziege anti-Maus IgG _2a Cy5-markierten (Jackson ImmunoResearch), 1:200 in BPB und Spin wie oben. Platz 30 ul Antikörper-Lösung auf die saubere Parafilm in einer feuchten Kammer und geben dazu Zellen auf Filter kopfüber auf den Antikörper fallen. Inkubieren 1 h bei RT.
8. Wiederholen Sie Schritt 4.6.
9. Dip-Zellen auf Filterpapier 3X in deionisiertem Wasser und Ort right Seite nach oben auf Mikroobjekttragerglaschen. Add 10-15 ul Halterung (10% [wt / vol] DABCO, 50% [wt / vol] Glycerin in destilliertem Wasser) auf der Oberseite der Zellen. Legen 18x18 mm micro Deckglas auf und mit Kosmetiktücher sanft drücken Sie die Mikro-Deckglas auf die Zellen. Seal mit Nagellack.
10. Analysieren Proben mit einem konfokalen Mikroskop. Wir verwendeten eine Microsystem LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc., die mit einem 63X Eintauchen in Wasser-Objektiv ausgestattet war.
11. Für die Herstellung von Figuren, anpassen und kombinieren Bilder mit Programmen wie Adobe Photoshop und Adobe Illustrator.

5. Repräsentative Ergebnisse

Beispiele, wie die Co-Expression von kleinen GTPasen stört VSVG Sortierung verweisen wir auf veröffentlichte Artikel entweder apikale missorting ^{3, 4} oder Hemmung der Oberfläche Lieferung ^7.

Abbildung 1. In dem Modell-Injektion, dh eine Injektion von nur das Plasmid kodiert VSVGts045-GFP, ist das Protein an der basolateralen Oberfläche gut polarisierten MDCK-Zellen geliefert, wie Oberflächen-Färbung (in rot, Abbildung 1 A) beurteilt. Beachten Sie, dass nicht alle der VSVGts045-GFP in der basolateralen Membran wird während der Verfolgungsjagd auf 31 geförderte ° C durch das umfangreiche intrazelluläre Signal für den Gesamt-Protein nachgewiesen (in grün, Abbildungen 1 A und B). In Zellen, die nicht gut polarisiert VSVGts045-GFP wird auch der apikalen Membran (Abbildung 1 B) geliefert werden. Wenn das Steuerelement Exemplare wie die Zelle in Abbildung 1 B anschaut, kann man nicht vertrauen Ihre Daten und haben das Experiment mit einer besseren polarisierten Zellen wiederholen. Scale-Bars sind 5 um.

Discussion

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Mikroinjektion Experiments sind die Qualität und Reinheit der DNA und die Polarität der Zellen. Ohne polarisierten Zellen, wird die Injektion Kontrolle bereits VSVG mistargeted haben und das Experiment kann nicht verwendet werden. Wenn die DNA ist von schlechter Qualität, kann die DNA verstopfen die Injektionsnadel, die zu schlechte oder gar keine Expression des gewünschten Proteins an alle. Auch ist es ratsam, Expressionsplasmide, die bekanntermaßen eine hohe Expression wie pRKV führen, sind zu verwenden.

Wenn Sie für das Sortieren von anderen Cargoproteine ​​Test wünschen, kann die Temperatur Verschiebung Protokolle geändert werden. Zum Beispiel, um Low-Density-Lipoprotein-Rezeptoren exprimieren, führen wir die Mikroinjektion bei 37 ° C durch eine 1 h Inkubation bei 37 ° C, 4 h bei 20 ° C (der Ladung in der TGN Verhaftung) und 2 h bei 37 ° C in Gegenwart von 0,1 mg / ml Cycloheximid, um das Protein an der Oberfläche jagen. Für einige Proteine ​​wie Fc-Rezeptoren, die Inkubationszeit bei 20 ° C können bis zu 2 h abhängig, wie schnell Ihre Ladung Protein synthetisiert gesenkt werden und wandert durch den sekretorischen Weg. Für eine detaillierte Beschreibung der Inkubationen, dass wir für verschiedene Güter Proteinen verwendet sehen Nokes et al., 2008 ^7.

Schließlich kann dieses Protokoll nicht nur für die Analyse von kleinen GTPasen verwendet werden, aber in der Theorie für alle Proteine ​​oder Proteinfragmente, dass Sie vermuten, kann eine Funktion in (polarisiert) Oberfläche Lieferzeit haben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage	Carl Zeiss, Inc.	Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator	Eppendorf	Custom order
Femtotips II (Microinjection needles)	Eppendorf	930000043
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Clear 12-mm transwell filter supports	Corning	3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit	Sigma-Aldrich	NA0400