Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

Summary

Este artigo detalha os procedimentos envolvidos na análise da superexpressão e GTPases pequenas células epiteliais polarizadas utilizando a técnica de microinjeção.

Abstract

Células epiteliais polarizar sua membrana plasmática em bioquímica e funcionalmente distintos domínios apical e basolateral onde o domínio apical enfrenta o 'livre' e superfícies da membrana basolateral é em contato com o substrato e as células vizinhas. Ambos os domínios de membrana são separados por junções apertadas, que formam uma barreira de difusão. Apical-basolateral polarização pode ser reproduzido com sucesso na cultura quando as células epiteliais como Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), as células são semeados em altas densidades, em filtros de policarbonato e cultivados por vários dias ^{1 2.} Estabelecimento e manutenção da polaridade celular é regulada por um conjunto de pequenas GTPases da superfamília Ras, como Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 e Rab13 ^{3 4 5 6 7.} Como todas as GTPases ciclo dessas proteínas entre um estado PIB-bound inativos e um estado GTP-bound ativo. Mutações específicas nas regiões de ligação de nucleotídeos interferir com esta bicicleta ^8. Por exemplo, Rab13T22N está permanentemente bloqueado no PIB forma e, assim, apelidado de "negativo dominante", enquanto Rab13Q67L já não pode hidrolisar GTP e é, portanto, trancado em um estado "ativo dominante" ^7. Para analisar a sua função em células negativo dominante e dominante alelos ativos de GTPases são normalmente expressos em níveis elevados para interferir com a função das proteínas endógenas ^9. Uma maneira elegante de alcançar altos níveis de superexpressão em um curto espaço de tempo é introduzir os plasmídeos que codificam as proteínas relevantes diretamente no núcleo das células cultivadas em polarizado filtro suporta o uso de técnica de microinjeção. Isso é muitas vezes combinada com a co-injeção de plasmídeos repórter que codificam os receptores da membrana plasmática que são especificamente classificadas para o domínio apical ou basolateral. A carga freqüentemente utilizado para analisar a carga de classificação para o domínio basolateral é um alelo sensível à temperatura da glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVGts045) ^10. Esta proteína não pode dobrar corretamente a 39 ° C e por isso serão retidos no retículo endoplasmático (ER), enquanto a proteína reguladora de interesse é montado no citosol. A mudança para a 31 ° C, então, permitir VSVGts045 dobrar corretamente, deixam o ER e viajar para a membrana plasmática ^11. Esta perseguição é geralmente realizado na presença de cicloheximida para prevenir a síntese de proteína ainda mais levando a resultados mais limpo. Aqui nós descrevemos em detalhe o procedimento de microinjecting plasmídeos em células polarizadas e incubações subseqüentes, incluindo mudanças de temperatura que permitem uma análise global das proteínas reguladoras envolvidas na triagem basolateral.

Protocol

1. Isolamento de DNA plasmidial

1. Use uma endotoxina livre de Sigma-Aldrich maxiprep kit para preparar DNA endotoxina livre de acordo com protocolo do fabricante. Este kit funciona para nós, porque é confiável remove qualquer endotoxinas das preparações de DNA. Endotoxinas que são injetados com o DNA em núcleos de células irá levar à morte celular.
2. Adicionar 100 ul de fenol / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) para o DNA isolado, vortex e centrifugação por 1 min a 13.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf. Transferir a fase superior de água em um novo tubo e adicionar 100 mL de clorofórmio / isoamylalcohol (24:1), vórtice e girar como acima. Transferir a fase superior de água contendo o DNA a um novo tubo. Este passo é necessário para remover qualquer proteína do DNA, o que impede o entupimento da agulha de microinjeção.
3. Precipitar o DNA pela adição de acetato de sódio (pH 6,0) para uma concentração final de 300 mM e 2 X de etanol 100% vol. Incubar a -20 ° C durante a noite. Spin-DNA por 20 min a 13.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf, lave uma vez com etanol 70%, e ressuspender em 300 endotoxina livre mL de água (Sigma-Aldrich).
4. Determinar a concentração de DNA. A concentração de DNA típico varia de 1 a 5 mg / mL.

2. Cultura de células MDCK

1. Dividir células MDCK. Contagem de células e de sementes de 4 X 10 ⁵ células para limpar filtros de 12 mm Transwell (0,4 mM tamanho dos poros, Corning Costar, 3460). Para um experimento contendo uma injeção de mock-controle e dois diferentes proteínas Rab mutante você precisa semente três filtros.
2. Células MDCK cultura em meio MEM com 2 mM L-glutamina 0,1 mg / ml de penicilina / estreptomicina e 7% (vol / vol) de soro fetal bovino (= media de crescimento MEM) a 37 ° CO C e 5% _2.,
3. Mudança de mídia na câmara basolateral todos os dias. Isso ajuda o processo de polarização, porque imita a situação de células epiteliais nos animais.
4. 2 dias cheque pós-semeadura em um microscópio se as células estão crescendo em uma monocamada fechado. Se você não consegue detectar todos os furos na monocamada, realize sua experiência no dia 3. Se ainda há buracos, faça sua experiência no dia 4.

3. Procedimento microinjeção e Pós-injeção incubações

1. No dia do experimento preparar 5 ml de mídia MEM crescimento mais 50 mM HEPES, em uma chapa de 60 mm x 15 para cada filtro e coloque em uma incubadora de 39 ° C. Além disso, criar um poço de uma placa de 12 bem com 1 ml meios de crescimento MEM acrescido de 50 mM HEPES e 0,1 mg / ml cicloheximida por filtro, e coloque em uma incubadora de 31 ° C.
2. Ligue o microscópio de microinjeção e definir sua fase aquecida a 39 ° C. Nós usamos um microscópio invertido (Axiovert 200, Carl Zeiss microfilmagem, Inc.) com uma fase aquecida, objetivos 10X e 32X, e um FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Por último, abra o tanque de gás nitrogênio, que abastece a mesa de ar com nitrogênio.
3. Diluir DNA com água filtrada (use filtro 0,2 m) para uma concentração final de 0,2 mg / ml em um volume total de 10 - 100 ul. Posteriormente, spin DNA em microcentrífuga Eppendorf a 13.000 rpm por 30 min. Remover parte superior e coloque em um novo tubo. Essa etapa assegura que quando você carrega o seu DNA diluído na agulha microinjeção você pode exatamente carga de DNA "limpa". Seu DNA está agora pronto para microinjeção.
4. Prepare suas células tomando o primeiro filtro para fora de sua placa de cultura. Com uma lâmina cirúrgica (Blade Feather cirúrgica, aço inoxidável, n º 11), cortar o filtro do suporte do filtro e coloque em 5 ml, 39 ° C meios de crescimento quentes MEM acrescido de 50 mM HEPES (60 x 15 mm chapa). Pesar o filtro na placa de cultura com a lâmina cirúrgica que você usou para cortá-lo para fora. Colocá-la no tal filtro que o buraco da lâmina cirúrgica envolve o meio do filtro. Coloque sua placa de cultura para o palco aquecida do microscópio.
5. 2-3 mL de carga de seu DNA diluído (neste caso a codificação plasmídeos VSVGts045-GFP = controle de injeção simulada) em uma agulha microinjeção (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), torça a tampa protetora da agulha e deixá-lo cair no chão . Agora a agulha está pronto para ser parafusado em seu compartimento. Para isso, pressione a tecla menu do seu InjectMan e verifique se a válvula está desligado. Enrosque a agulha no respectivo suporte, cuidado para não estragar na agulha muito bem como isso pode levar à ruptura. Agora, pressione a tecla de menu novamente, o P aplicado _c vai impedir a mídia de ser sugado para dentro da agulha durante o procedimento microinjeciton. Finalmente, toque o joystick para apagar homing armazenados.
6. Para diminuir a agulha para as células, use a objetiva de 10X e trazer a agulha para o feixe de luz acima do líquido. Agora concentrar-se nas células, trazer o foco para cima novamente, girando o anel de foco até 180 °, e encontrar a agulha. Posteriormente, mova lentamente a agulha em foco, em seguida, trazer de novo fora de foco (trabalhando para trazer as células para o foco de novo), derrubar agulha paracus novamente. Repita até que a agulha toca a superfície da mídia, altura em que tudo o que você vai ver é um halo. Quando você chegar a um ponto em que as células estão em foco, mas a agulha ainda é fuzzy (isto é, fora do plano focal) a mudança para o objectivo 32X e multa ajustes grossos.
7. Definir o z-limite tocando a membrana apical com a ponta da agulha e subtraindo cerca de 10 mM como os núcleos estão colocando cerca de 10 M abaixo da membrana apical.
8. Depois de definir o z-limite, encontrar a pressão de injeção direita. Iniciar a 95 PSI. Se a pressão for muito alta, suas células vão explodir. Se a sua pressão é muito baixa, você verá um ponto branco que se mantém, mas nada acontece. Com uma injeção bem sucedido, você vai ver uma mudança de fase sem alterar o tamanho da célula. Para a injeção, trazer a agulha de alguns microns fora do plano focal o mais rápido possível. Mire com a agulha acima do núcleo (ou seja, no meio de uma célula individual) e pressione o botão de injecção do seu joystick, mas não mantenha o botão pressionado.
9. 100-500 injetar células dentro do buraco de sua lâmina cirúrgica que se encontra em suas células. Quando você terminar, coloque as suas células com a placa de cultura e lâmina cirúrgica em uma incubadora de 39 ° C, e incubar por 2 h. Durante este tempo, VSVGts045-GFP é expressa e secretada no ER. No entanto, a 39 ° C, VSVGts045-GFP não pode dobrar corretamente e, portanto, não pode deixar o ER. Enquanto isso, a pequena GTPase de interesse irá acumular no citosol em co-injeção de experimentos.
10. Após 2 h, coloque o seu células em 1 ml de mídia crescimento MEM acrescido de 50 mM HEPES e 0,1 cicloheximida mg / ml em uma placa de 12 poços e incubar por 2 horas a 31 ° C. Durante este período de perseguição, VSVGts045-GFP irá dobrar corretamente, deixam o ER e é entregue à superfície da célula.
11. Repita os passos 3,1-3,10 para filtros dois (injetar plasmídeos codificando VSVGts045-GFP e, por exemplo V5-tagged Rab13T22N) e três (injetar plasmídeos codificando VSVGts045-GFP e, por exemplo V5-tagged Rab13Q67L). Cada injeção demora cerca de 20-60 min. No entanto, é absolutamente crucial para o tratamento de todas as maneiras o mesmo filtro em todo o incubações de temperatura e mudança de coloração da superfície até que você corrigir as células. Após a fixação, você pode executar o resto do seu protocolo de coloração para todos os filtros, ao mesmo tempo.

4. A coloração da superfície de Análise de imunofluorescência

Note, a fim de evitar o branqueamento do sinal da GFP VSVGts045-GFP, proteger espécies de luz, cobrindo com papel alumínio durante todos os procedimentos subseqüentes.

1. Se você deseja executar manchas na superfície, coloque suas células em um prato de cultura em uma placa de metal no gelo e lave as células com 1X PBS gelado ^{2 +} (PBS [0,2 g / litro KCl, 0,2 g / litro KH ₂ PO _4, 8 g / litro de NaCl e 2,17 g / litro Na ₂ HPO ₄ x 7 H ₂ O] mais 0,1 g / litro CaCl ₂ e 0,1 g / litro MgCl ₂ x 6 H ₂ O). Posteriormente, coloque 30 mL de um anticorpo que reconhece a ectodomínio de sua proteína, neste caso, o anticorpo monoclonal de camundongo TK1 (IgG _1, obtidos a partir do final de Thomas Kreis), em parafilme limpa colocada sobre a placa de metal no gelo. Coloque o filtro com suas células de cabeça para baixo sobre a queda e adicione algumas gotas de anticorpos para a parte de trás do filtro. Incubar por 1 hora no gelo.
2. Células colocar em uma placa de 12 poços, lave 3X com PBS gelado ^{2 +} (ou RT quente PBS ^{2 +} sem coloração da superfície antes), e corrigir com paraformaldeído a 3% por 15 min em temperatura ambiente.
3. Lave as células uma vez com PBS ^{2 +} e deixar em PBS ^{+ 2} por 5 min.
4. Incubar as células no bloqueio / buffer permeabilização (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] saponina em PBS ^{2 +)} com 10% [vol / vol] soro de cabra. Incubar 1 h em temperatura ambiente.
5. Diluir anticorpos primários para detectar a expressa Rab GTPase, neste exemplo anti-V5 (mouse anticorpo monoclonal IgG _2a, Invitrogen), 1:200 na BPB. Spin-anticorpos diluídos em uma microcentrífuga Eppendorf por 10 min a 13.000 rpm. ML lugar 30 da solução de anticorpos em parafilme limpa colocado em uma câmara úmida. Coloque as células no filtro de cabeça para baixo sobre a queda de anticorpos e incubar por 1 h em temperatura ambiente.
6. Células lugar de volta (até o lado direito) em uma placa de 12 poços e lavar 5X mais de 30 min com BPB na RT.
7. Diluir apropriado anticorpos secundários, neste caso de cabra anti-IgG de rato ₁ Alexa 594-rotulados (para detecção de VSVG na superfície, Invitrogen), e Cy5 marcado com anticorpos secundários para reconhecer o seu GTPase Rab, neste exemplo de cabra anti-IgG de rato _2a Cy5-rotulados (ImmunoResearch Jackson), 1:200 em BPB e girar como acima. Coloque 30 mL de solução de anticorpos em parafilme limpa em câmara úmida e células lugar na cabeça de filtro para baixo sobre a queda de anticorpos. Incubar 1 h em temperatura ambiente.
8. Repita o passo 4.6.
9. Dip células em filtro de 3X em água deionizada e coloque racima do lado ight para microslides. Adicionar 10-15 mL de montagem (10% [wt / vol] DABCO, 50% [wt / vol] glicerol em água destilada) na parte superior das células. Lugar 18X18 milímetros tampa de vidro micro em cima e usando tecidos faciais pressione suavemente a tampa de vidro para a micro células. Seal com unha polonês.
10. Analisar amostras com um microscópio confocal. Usamos um Microsystem LSM 510, Carl Zeiss microfilmagem, Inc. que foi equipado com uma lente de 63X de imersão em água.
11. Para a preparação das figuras, ajustar e combinar imagens utilizando programas como o Adobe Photoshop e Adobe Illustrator.

5. Resultados representante

Para exemplos de como a co-expressão de GTPases pequenas interfere com a classificação VSVG gentilmente referem-se a artigos publicados para qualquer missorting apical ^{3, 4} ou inibição de entrega de superfície ^7.

Figura 1. Na injeção simulada, ou seja, uma injeção de codificação apenas o plasmídeo VSVGts045-GFP, a proteína é entregue à superfície basolateral de bem-polarizada células MDCK, a julgar pela coloração de superfície (em vermelho, Figura 1 A). Note que nem todos os VSVGts045-GFP é entregue à membrana basolateral durante a perseguição a 31 ° C como evidenciado pelo sinal extensa intracelular para a proteína total (em verde, Figuras 1 A e B). Em células que não são bem-polarizada VSVGts045-GFP será entregue também à membrana apical (Figura 1 B). Se as amostras de seu controle parecido com o celular na Figura B 1, você não pode confiar seus dados e tem que repetir o experimento com melhor polarizado células. Barras de escala são 5 mm.

Discussion

Os passos mais críticos para um experimento de microinjeção de sucesso são a qualidade ea pureza do DNA e da polaridade de suas células. Sem células polarizadas, o seu controle de injeção já terá mistargeted VSVG eo experimento não pode ser usado. Se o DNA é de má qualidade, o DNA pode entupir a agulha de injeção levando a pouca ou nenhuma expressão da proteína desejada de todo. Além disso, é aconselhável a utilização de plasmídeos de expressão que são conhecidos por levar a níveis de alta expressão, como pRKV.

Se você desejo de teste para triagem de proteínas de outras cargas, os protocolos de mudança de temperatura pode ser modificada. Por exemplo, para expressar receptores de lipoproteína de baixa densidade, realizamos a microinjeção a 37 ° C seguido por uma incubação h 1 a 37 ° C, 4 h a 20 ° C (para prender a carga no TGN) e 2 horas a 37 ° C na presença de cicloheximida 0,1 mg / ml para perseguir a proteína para a superfície. Para algumas proteínas, tais como receptores Fc, o tempo de incubação a 20 ° C pode ser reduzido para 2 h depende de quão rápido a sua carga de proteína é sintetizado e viaja através da via de excreção. Para uma descrição detalhada das incubações que usamos para as proteínas de carga diferentes ver Nokes et al., 2008 ^7.

Finalmente, este protocolo não pode ser usado apenas para a análise de GTPases pequeno, mas, em teoria, para todas as proteínas ou fragmentos de proteína que você suspeita pode ter uma função no (polarizado) a entrega de superfície.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage	Carl Zeiss, Inc.	Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator	Eppendorf	Custom order
Femtotips II (Microinjection needles)	Eppendorf	930000043
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Clear 12-mm transwell filter supports	Corning	3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit	Sigma-Aldrich	NA0400