Summary
I denne artikel præsenterer vi en simpel, praktisk teknik for cerebrovaskulære støbning, der er let at udføre og kan udnyttes til billede i vaskulære træet af den voksne musen hjernen.
Abstract
Vaskulær billeddannelse er af afgørende betydning i den kliniske diagnose og behandling af cerebrovaskulære sygdomme, såsom hjerne arteriovenøse malformationer (BAVMs). Dyremodeller er nødvendige for at studere etiopathology og mulig behandling for cerebrovaskulære sygdomme. Imaging vaskulaturen i store dyr er relativt nemt. Men udvikling af fartøj billeddiagnostiske metoder til murine hjernesygdom modeller er ønskeligt på grund af omkostningerne og tilgængeligheden af genetisk modificerede mus linjer. Imaging den murine cerebrale vaskulære træ er en udfordring. Hos mennesker og større dyr, guldstandarden for at vurdere angioarchitecture på makrovaskulære (konduktans) niveau er x-ray kateter kontrast-baserede angiografi, en metode ikke egnet til små gnavere.
I denne artikel præsenterer vi en metode til cerebrovaskulær støbning, der giver en holdbar skelet af hele vaskulære seng, herunder arterier, vener og kapillærer, der kan analyseres ved hjælp af mange different modaliteter. Komplet støbningen af mikrokar på musen cerebrovasculature kan være svært, men er disse udfordringer op i dette trin-for-trin-protokollen. Gennem intracardial perfusion af det vaskulære casting materiale, er alle skibe af kroppen støbt. Hjernen kan derefter fjernes og tydeliggøres ved hjælp af organisk opløsningsmiddel methyl salicylat. Tredimensionelle billeder af hjernen blodkar kan visualiseres enkelt og billigt med alle konventionelle brightfield mikroskop eller dissektionsmikroskop. Den støbt cerebrovasculature kan også afbildet og kvantificeres ved hjælp af mikro-computertomografi (mikro-CT) 1. Hertil kommer, efter at være blevet afbildet kan de afgivne hjernen være indlejret i paraffin for histologisk analyse.
Fordelen ved denne vaskulære casting metoden i forhold til andre teknikker, er dens brede tilpasning til forskellige analytiske værktøjer, herunder brightfield mikroskopisk analyse, CT-scanning på grund af den røntgenfaste karakteristisketegnende for det materiale, samt histologiske og immunhistokemiske analyse. Dette effektiv brug af væv kan spare dyre forbrug og reducere omkostningerne. Vi har for nylig demonstreret anvendelse af denne metode til at visualisere de uregelmæssige blodkar i en musemodel af voksne BAVM på et mikroskopisk niveau 2, og give yderligere billeder af misdannede skibe afbildes af mikro-CT-scanning. Selv om denne metode har ulemper og er måske ikke ideel til alle typer af analyser, er det en enkel, praktisk teknik, der nemt kan læres og almindeligt anvendt på vaskulær støbning af blodkarrene i hele kroppen.
Protocol
1. Clearing Blod fra vaskulaturen
- Bedøver musen ved intraperitoneal injektion af 100 mg / kg ketamin med 10 mg / kg xylazin fortyndet i 0,25 ml saltvand.
- Når bedøvelsen er blevet bekræftet af nogen reaktion på en pote knibe, en saks til at foretage et snit på tværs af brystet med en saks lige under xyphoid processen, skære igennem mellemgulvet, og skåret op mellem dorsal og ventral segment af Brystkassen at eksponere brysthulen. Expose hjertet ved at folde op brystbenet og tilstødende brystvæg og sikkert med hemostat. Åbn hjertesaek med en pincet til at eksponere hjertet.
- Tænd perfusion pumpe (100mmHg tryk) tilsluttet varme PBS plus heparin (5 enhed / ml) i varmt vandbad ved 37 ° C og rør, med en stump 22 gauge nål på tilbagetrækningen.
- Stik nålen ind i venstre hjertekammer, nær spidsen af hjertet. Umiddelbart skar højre atrium til at aktivere systemisk blod udstrømning og fortsæt skylningen, indtil blodet is ud af omløb.
2. Perfusion af Casting Agent i det vaskulære system
- Forbered Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) støbning opløsning pr producentens protokol: Bland 5 ml af MV fortyndingsmiddel med 4 ml filtreret MV sammensatte. Tilføj 450μl (5%) af katalysator (MV hærder). Løsning arbejdstid er 20 minutter, men mix umiddelbart før brug for at sikre korrekt viskositet.
- Træk støbning agent løsning i en 10 ml sprøjte, vedhæfte en stump 20 gauge kanyle på sprøjten, og fyld nål med løsning.
- Stik nålen ind i venstre hjertekammer gennem det samme hul bruges til at skylle blodet. Sikker kanyle på plads med hemostat klemme på hjertet.
- Indsprøjtes støbning agent opløsningen langsomt ind i venstre hjertekammer på ca 3 ml / min. Overtryk kan føre til forkerte strømmen af støbning agent eller potentielle fartøj brud.
- Se efter tegn på vellykket perfusion, herunder: visualisering af støbteING agent i tarmen og leveren kar, distal lemmer misfarvning, og næse og tunge misfarvning. Juster nål hvis det er nødvendigt for at opnå ordentlig perfusion.
3. Indsamling og behandling af væv
- Fjern hjernen og plads i 4% paraformaldehyd natten over ved 4 ° C.
- Dehydrer hjerne ved at placere fra paraformaldehyd direkte ind i stadigt stigende grad koncentreret EtOH ved stuetemperatur: 25% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 2 dage, og 100% EtOH, 2 dage .
- Afklar hjernevævet omkring blodkar ved at nedsænke perfunderet hjernen i methyl salicylat i 2 dage ved stuetemperatur.
- Vaskulaturen af hele unsectioned afklaret hjernen kan filmede med hjernen nedsænket i Methylsalicylat under et dissektionsmikroskop (fig. 1) (Leica MZFL III mikroskop, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) eller brightfield mikroskop (Fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems).
- Reclarificationkan ske, hvis vævet ikke er helt ryddet. Fra methyl salicylat, overførsel hjernen til 95% EtOH i 2 dage, 100% EtOH i 2 dage, og methyl salicylat i 2 dage.
4. Mikro-CT Imaging eller histologiske Application-Tissue Forberedelse
- Hjernen kan filmede med mikro-CT direkte efter afklaring eller efter tilførsel (Fig. 4).
- At forberede hjernevæv for histologisk analyse, rehydrere hjernen via seriel fortyndet EtOH: 100% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 2 dage, 25% EtOH, 2 dage , og opbevar det i PBS. Hjernen kan derefter indlejret i paraffin ved hjælp af en standard procedure.
5. Repræsentative resultater
Efter kar støbning, kan cerebrovasculature ses makroskopisk på hjernens overflade (figur 1A). Den vaskulære træet inde i parenkym kan visualiseres følgende præcisering (Fig. 1B). De detaljerede vaskulære strukturkan afbildes og analyseres under et brightfield mikroskop (fig. 2), dissekere omfang (Fig. 3), og med mikro-CT-scanning (Fig. 4). Brug brightfield mikroskopi, kan vaskulaturen ses ved forskellige fokale planer uden at inddele hjernen (Fig. 2A) samt individuelle mikrokar ved højere forstørrelse (Fig. 2B). Under en dissekering omfang, kan man se hele vaskulære struktur i én fokusplan, muliggør en bedre visualisering af den tredimensionelle struktur af cerebrovasculature (Fig. 3). Billeder taget under et dissektionsmikroskop kan vise stort fartøj morfologi og hele hjernen kar, men mangler detaljer vist på billeder taget med brightfield mikroskopi (Fig. 2B). Denne teknik har gjort det muligt for os at opdage uregelmæssig fartøjer i vores eksperimentelle BAVM voksne mus model 2. Figur 5 viser et eksempel på de samme uregelmæssige skibe opdaget af mikro-CT-scanning (Fig. 5A) og brightfield mikroskop (Fig. 5B). Sammen disse data viser, at vi kan analysere than samme prøve med flere billeddiagnostiske værktøj efter vaskulære støbning.
Figur 1. Whole musen hjernen følgende vaskulære støbning. Før (A) og efter (B) klaring ved methyl salicylat opløsningsmiddel. Fartøjer kan tydeligt visualiseres på hjernens overflade (A) og i parenkym følgende præcisering procedure (B).
Figur 2. Brightfield mikroskop billeder af afklares vaskulære støbt hjernen. Hjernen kan afbildes på forskellige fly og på forskellige forstørrelse niveauer. Scale Bar 200μm (A) og 50μm (B).
Figur 3. Dissektionsmikroskop billede på 1x, der viser hele den voksne mus hjernen cerebrovasculature fra en dorsal udsigt.
<img alt = "Figur 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" />
Figur 4. Micro-CT-scanning billede af den samme hele den voksne mus hjernen vist i figur 3 fra en dorsal udsigt.
Figur 5. Anvendelse af vaskulære casting metode til at påvise en hjerne arteriovenøs misdannelse. A) Mikro-CT-scanning af vaskulære støbt hjerne viser regionen udvidet, uregelmæssig AVM-lignende fartøjer i højre hjernehalvdel fra en ventrale udsigt. Forstørret billede af regionen (hvid boks) er vist til højre. B) Samme uregelmæssigt skibe visualiseres under brightfield mikroskop på 50x forstørrelse. Skala bar 50 μm.
Discussion
Vi rapporterer her en metode til støbning af voksne mus cerebrovasculature der kan være afbildet med forskellige modaliteter. Anvendelsen af denne metode for sygdommen modellen BAVM muliggør 3D-analyse af uregelmæssige fartøjer. Potentielle fremtidige undersøgelser omfatter kvantificering af mikro-CT billeder, histologiske analyser af væv, og diagnose af vaskulære sygdomsprogression.
Almindelige problemer og Forslag
Komplet perfusion af hjernen vaskulaturen er ikke altid opnås. Have nok pres for at nå den distale blodkar uden brud i venstre atrium eller aorta er en udfordring. For at overvinde denne, anvende konsekvent presset på ca 100mmHg. Også, justere nålens position til at sikre passende udstrømning af støbning agent i aorta. Det er vigtigt, at carotis arterierne ikke er begrænset, så casting agent kan nå hjernen fartøjer. Kritiske procedurer, der korrelerer med forbedrede lille fartøj prfusion er: (1) korrekt clearing af blod fra kar, (2) filtrering af den støbning agent, og (3) nål placering under støbningen agent injektion. Der bør udvises forsigtighed for at undgå injektion af støbning agent i venstre atrium og lunge. Andre forskere har med succes perfunderet musen 3 og rotter 4 cerebrovasculature uden brug af yderligere procedurer. Manuel analyse af Microfil perfunderet skibe kontrastfarves med hemotoxylin viste 93% fartøj lumen perfusion 5. Altid kassere eller helt ren ethvert værktøj, der kommer i kontakt med støbning agent som det vil polymerisere hurtigt, og værktøjer ikke kan bruges til flere fag. Afklaring af det omgivende musen hjernevæv kan være udfordrende. Efter nedsænkning i methyl salicylat, kan vævet stadig vises uigennemsigtig, hvilket gør fartøj billeddannelse vanskelig. Sikring af korrekt dehydrering og præcisering bør løse dette problem. Placering af hjernevæv på en rocker i løbet af alkohol og methyl salicylate behandling kan forbedre væv afklaring.
Ulemperne ved Teknik
Begrænsningerne af denne teknik kan nævnes: (1) er det nødvendigt at injicere casting agent løsning umiddelbart efter opblanding det, som det vil blive tykkere hurtigt efter katalysatoren er tilsat, (2) udslagsgivende agent fylder stort konduktans skibe nemt, men det gør ikke pålideligt fylde mindre skibe, som f.eks arterioler (modstand fartøjer) og kapillærer (nærende fartøjer), og (3) det er ikke den bedste røntgenfaste kontrast for mikro-CT-scanning, selv om nogle grupper foretrækker Microfil for mikro-CT scanning 1,6. Men efter forslag foreslås ovenfor, herunder korrekt nål placering, skibets position og perfusion pres, kan fuldføre støbning af mindre fartøjer skal opnås. Tilpasningsevne til forskellige analyse værktøjer gør denne agent et værdifuldt redskab til at analysere cerebrovaskulære struktur, herunder arteriel og venøs cirkulation, med forskelligeperspektiver.
Anvendelser af Teknik
Fordelen ved denne metode er dens brede anvendelse potentiale. Den støbte fylder alle fartøjer, herunder arterier, vener og kapillærer af alle væv i kroppen, så vaskulære strukturer i flere organer af forskellige arter kan analyseres. Tidligere har andre grupper brugt denne perfusion til store 7 og lille 8 fartøjer i menneskelige, abe 9, får 10, rotte 4,11,12, og mus 3,13. Vi har nu viser tegn på at bruge denne teknik i at analysere strukturen af mikrokar på mus hjernen hos både raske og syge stater 2. Derudover er der Microfil løsninger med forskellige viskositeter til rådighed for perfuse fartøjer af forskellige størrelser og forskellige farver til at forbedre visualiseringen af fartøjer i forskellige organer. For eksempel kan rød let visualiseres i det blege hjernen parenkym, og gul kontrast godt medmørkerød myokardiet. Desuden, da materialet er røntgenfaste, kan vaskulaturen skal afbildes med mikro-CT-scanning for at få en 3D drejelig billede. Det væv kan også bruges til paraffin sektioner og histologisk analyse efter at være blevet afbildet.
Konklusion
Vi viser her en protokol til at gøre en vaskulær støbt af blodkarrene af den voksne mus hjernen, som kan tilpasses ved hjælp af forskellige analyseteknikker til at studere den morfologiske struktur cerebrovasculature. Vi har også fremlagt beviser for anvendelsen af denne metode til en model af BAVM sygdommen staten, repræsenteret ved forstørret, uregelmæssigt formet fartøjer, shunt blod fra arteriel til venøs cirkulation. Der er en række af vaskulære støbning metoder til rådighed. Den enkle Protokollen giver vi her for en vaskulær støbte kan bruges som et redskab til at undersøge vaskulaturen af den voksne musen hjernen ved hjælp af forskellige billeddiagnostiske metoder.
Disclosures
Eksperimentelle procedurer for brug af forsøgsdyr, blev godkendt af Institutional Animal Care og brug udvalg fra University of California, San Francisco (UCSF).
Acknowledgments
Forfatterne takker Voltaire Gungab for at få hjælp med manuskriptet forberedelse. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra: National Institutes of Health (T32 GM008440 til EJ Walker, R01 NS27713 til WL Young, P01 NS44155 til WL Young og H. SU), og R21 NS070153 til H. Su, og den amerikanske Heart Association (AHA 10GRNT3130004 til H. SU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
References
- Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs. Bone. 43, 195-202 (2008).
- Walker, E. J. Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease. Ann. Neurol. , Forthcoming (2011).
- Iqbal, U. Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours. Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).
- Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat. 145, 473-480 (2003).
- Chugh, B. P. Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography. Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. ainey, L, L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).
- Fossett, D. T., Caputy, A. J. Operative Neurosurgical Anatomy. , Thieme Medical Publishers. New York. (2002).
- Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta). Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).
- Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).
- Brady, J. M., Cutright, D. E. A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat. Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).
- Evan, A. P., Dail, W. G. Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney. Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
