Summary
Dans cet article, nous présentons une technique simple, pratique pour la coulée vasculaire cérébral qui est facile à réaliser et peut être utilisé à l'image de l'arbre vasculaire du cerveau de souris adulte.
Abstract
Imagerie vasculaire est cruciale dans le diagnostic clinique et la gestion des maladies cérébro-vasculaires, tels que des malformations artério-veineuses cérébrales (BAVMs). Les modèles animaux sont nécessaires pour étudier les thérapies étiopathogénie et le potentiel de maladies cérébrovasculaires. Imagerie de la vascularisation chez les gros animaux est relativement facile. Cependant, le développement de méthodes d'imagerie navire de modèles murins des maladies du cerveau est souhaitable en raison du coût et la disponibilité de lignées de souris génétiquement modifiées. Imagerie de l'arbre vasculaire cérébral murin est un défi. Chez les humains et les animaux plus gros, le gold standard pour évaluer la angioarchitecture au macrovasculaires (conductance) de niveau est de radiographie de contraste à base de cathéter angiographie, une méthode qui n'est pas adapté pour les petits rongeurs.
Dans cet article, nous présentons une méthode de coulée cérébrovasculaires qui produit un squelette durable de la totalité du lit vasculaire, y compris les artères, veines et capillaires qui peuvent être analysées à l'aide de nombreuses dmodalités DIFFÉRENTES. Casting complet des microvaisseaux de l'cerebrovasculature souris peut être difficile, toutefois, ces défis sont abordés dans ce protocole étape par étape. Grâce à perfusion intracardiaque de la matière coulée vasculaire, tous les vaisseaux du corps sont coulés. Le cerveau peut alors être retiré et clarifié à l'aide du salicylate de méthyle solvant organique. Imagerie tridimensionnelle des vaisseaux sanguins du cerveau peuvent être visualisées de manière simple et peu coûteuse avec un microscope à fond clair conventionnel ou microscope à dissection. Le cerebrovasculature coulé peut également être visualisés et quantifiés à l'aide de micro-tomographie par ordinateur (micro-CT) 1. En outre, après avoir été photographiée, le cerveau coulé peut être incorporé dans de la paraffine pour l'analyse histologique.
L'avantage de cette méthode de coulée vasculaires par rapport aux autres techniques d'adaptation est son éventail de divers outils d'analyse, y compris l'analyse microscopique fond clair, la tomodensitométrie en raison de la caractérisation radio-opaquetéristique de la matière, ainsi que l'analyse histologique et immunohistochimique. Cette utilisation efficace de l'utilisation de tissus peut sauver des animaux et réduire les coûts. Nous avons récemment démontré l'application de cette méthode pour visualiser les vaisseaux sanguins irréguliers dans un modèle murin de BAVM adultes à un niveau microscopique 2, et fournir des images supplémentaires des vaisseaux malformés imagés par micro-CT scan. Bien que cette méthode a des inconvénients et peut-être pas idéal pour tous types d'analyses, il est une technique simple, pratique qui peut être facilement apprises et largement appliquée à la coulée vasculaire des vaisseaux sanguins dans l'organisme.
Protocol
1. Effacement de sang de vaisseaux sanguins
- Anesthetize la souris par injection intrapéritonéale de 100 mg / kg de kétamine à 10 mg / kg de xylazine dilué dans 0,25 ml de solution saline.
- Une fois l'anesthésie a été confirmée par aucune réponse à une pincée de patte, utiliser des ciseaux pour faire une incision sur la poitrine avec des ciseaux juste en dessous du processus xiphoïde, couper à travers le diaphragme, et couper entre le segment dorsale et ventrale de la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique. Exposer coeur en repliant le sternum et la paroi thoracique adjacentes et sécurisé avec pince hémostatique. Ouvrez le sac péricardique avec des pincettes pour exposer le cœur.
- Tournez sur la pompe de perfusion (100 mmHg de pression) connecté à chaud PBS plus héparine (5 unités / ml) solution dans le bain d'eau chaude à 37 ° C et les tubes avec une aiguille de calibre 22 émoussée sur la sortie.
- Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche, près de la pointe du cœur. Immédiatement à ciel ouvert l'oreillette droite afin de permettre des sorties artérielle systémique et continuer à rincer jusqu'à ce sang, jes retirés de la circulation.
2. Perfusion d'agent de casting dans le système vasculaire
- Préparer Microfil (Flow Tech, Inc Carver, MA) solution de moulage par protocole du fabricant: Mélangez 5 ml de diluant MV avec 4 ml de composé MV filtré. Ajouter 450μl (5%) de catalyseur (durcisseur MV). Temps de solution de travail est de 20 minutes, mais mélanger immédiatement avant l'emploi afin d'assurer une viscosité adéquate.
- Retirer coulée solution d'agent dans une seringue de 10 ml, joindre une aiguille de calibre 20 émoussée à la seringue et l'aiguille avec remplissez solution.
- Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche par le même trou utilisée pour la chasse dans le sang. L'aiguille sécurisée en place avec pince hémostatique sur le cœur.
- Injecter la solution agent de casting lentement dans le ventricule gauche à environ 3 ml / min. Une pression excessive peut conduire à des flux incorrecte agent de casting ou de rupture de la cuve potentiels.
- Rechercher des signes de la perfusion de succès, notamment: la visualisation des suffragesl'agent d'ING dans le système vasculaire intestin et le foie, la décoloration membre distal, et le nez et décoloration de la langue. Réajustez aiguille si nécessaire pour atteindre une perfusion adéquate.
3. Collecte et traitement des tissus
- Retirez le cerveau et les placer dans du paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C.
- Déshydrater du cerveau en plaçant des paraformaldéhyde directement dans EtOH en plus concentré à température ambiante: 25% EtOH, 1 jour, 50% EtOH, 1 jour, 75% EtOH, 1 jour, 95% EtOH, 2 jours, et 100% EtOH, 2 jours .
- Clarifier les tissus du cerveau autour des vaisseaux sanguins en immergeant le cerveau perfusé au salicylate de méthyle pendant 2 jours à température ambiante.
- Vascularisation du cerveau entier clarifié non scié peut être visualisé avec le cerveau plongé dans du salicylate de méthyle sous un microscope à dissection (fig. 1) (Leica III MZFL microscope Leica Microsystems, Bannockburn, IL) ou microscopie fond clair (fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems).
- Reclarificationpeut être fait si le tissu n'est pas complètement effacée. Du salicylate de méthyle transfert de cerveau, d'EtOH à 95% pendant 2 jours, 100 EtOH% pendant 2 jours, et du salicylate de méthyle pendant 2 jours.
4. Micro-CT Imaging ou histologique des tissus Application-Préparation
- Le cerveau peut être imagée en utilisant des micro-CT directement après clarification ou après ré-hydratation (Fig. 4).
- Pour préparer les tissus du cerveau pour l'analyse histologique, réhydrater le cerveau par EtOH diluée série: 100% EtOH, 1 jour, 95% EtOH, 1 jour, 75% EtOH, 1 jour, 50% EtOH, 2 jours, 25% EtOH, 2 jours , et stocker dans le PBS. Le cerveau peut alors être inclus dans la paraffine en utilisant une procédure standard.
5. Les résultats représentatifs
Après coulée vasculaire, l'cerebrovasculature peut être vu sur le macroscopiquement la surface du cerveau (Fig.1A). L'arbre vasculaire à l'intérieur du parenchyme peuvent être visualisées précisions suivantes (Fig. 1B). La structure détaillée vasculairespeuvent être visualisés et analysés au microscope fond clair (Fig. 2), la dissection étendue (fig. 3), et avec la micro-tomographie (fig. 4). En utilisant la microscopie en fond clair, la vascularisation peut être consulté à différents plans focaux, sans sectionner le cerveau (figure 2A), ainsi que microvaisseaux individu au plus fort grossissement (figure 2B). Sous un microscope à dissection, on peut voir toute la structure vasculaire dans un plan focal, permettant une meilleure visualisation de la structure tridimensionnelle de l'cerebrovasculature (Fig. 3). Les images prises sous un microscope à dissection peut présenter une morphologie grand navire et de la vascularisation du cerveau entier, mais il leur manque les détails montré sur les photos prises avec la microscopie fond clair (figure 2B). Cette technique nous a permis de détecter des vaisseaux irréguliers dans notre modèle expérimental chez la souris adulte BAVM 2. La figure 5 montre un exemple des mêmes vaisseaux irréguliers détectés par des micro-tomographie (figure 5A) et microscope à fond clair (Fig. 5B). Ensemble, ces données montre que nous pouvons analyser til même échantillon avec de multiples outils d'imagerie vasculaire après la coulée.
Figure 1. Cerveau de souris entières suivantes coulée vasculaire. Avant (A) et après (B) la clarification au salicylate de méthyle solvant. Les navires peuvent être clairement visualisée sur la surface du cerveau (A) et dans la procédure du parenchyme précisions suivantes (B).
Figure 2. Images de microscopie en fond clair d'clarifié le cerveau coulé vasculaire. Cerveau peuvent être imagées à différents plans et à des niveaux de grossissement différent. Échelle Barre 200μm (A) et 50 microns (B).
Figure 3. Dissection image du microscope à 1x montrant toute cerebrovasculature cerveau adulte de souris à partir d'un point de vue dorsale.
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Figure 4. Micro-CT scan image du même cerveau d'adulte de souris montre la figure 3 d'une vue dorsale.
Figure 5. Application de la méthode coulée vasculaires pour détecter une malformation artério-veineuse cérébrale. A) Les micro-CT scan du cerveau coulé vasculaires montre région élargie, irrégulière, comme l'AVM-vaisseaux dans l'hémisphère droit d'une vue ventrale. Image agrandie de la région (boîte blanche) est montré sur la droite. B) Même vaisseaux irréguliers visualisés au microscope à un grossissement de 50x fond clair. La barre d'échelle 50 microns.
Discussion
Nous rapportons ici une méthode pour la coulée de cerebrovasculature souris adulte qui peuvent être imagées avec des modalités différentes. L'application de cette méthode à la BAVM modèle de la maladie permet une analyse 3D de vaisseaux irréguliers. Potentiel de futures études incluent la quantification des micro-CT des images, l'analyse histologique du tissu, et le diagnostic de la progression de la maladie vasculaire.
Problèmes communs rencontrés et suggestions
Perfusion complète de la vascularisation du cerveau n'est pas toujours atteint. Ayant assez de pression pour atteindre les vaisseaux sanguins distale sans rupture de l'oreillette gauche ou l'aorte est un défi. Pour surmonter ce problème, appliquez une pression constante d'environ 100 mmHg. Aussi, d'ajuster l'aiguille mesure d'assurer des sorties approprié de coulée agent dans l'aorte. Il est important que les artères carotides sont pas limités donc l'agent coulée peut atteindre les vaisseaux du cerveau. Procédures critiques qui sont en corrélation avec les petits vaisseaux améliorés parla fusion sont les suivants: (1) de compensation adéquate du sang de la vascularisation, (2) la filtration de l'agent de casting, et placement de l'aiguille (3) pendant l'injection agent de casting. Des précautions doivent être prises pour éviter toute injection d'agent de casting dans l'oreillette gauche et du poumon. D'autres chercheurs ont réussi à perfusé de souris et de rat 3 4 cerebrovasculature sans recourir aux procédures supplémentaires. L'analyse manuelle des vaisseaux perfusés Microfil contrecolorées avec hemotoxylin montré 93% des navires lumière perfusion 5. Toujours jeter ou nettoyer complètement un outil qui vient en contact avec l'agent de casting car il va polymériser rapidement, et les outils ne peuvent pas être utilisés pour de multiples sujets. Clarification du tissu entourant le cerveau de souris peuvent être difficiles. Après une immersion dans le salicylate de méthyle, le tissu peut apparaître encore opaques, rendant l'imagerie navire difficile. Assurer la déshydratation et une clarification devrait résoudre ce problème. Placer le tissu cérébral sur une bascule au cours d'alcool et de méthyle sle traitement peut améliorer la précision alicylate tissus.
Inconvénients de la technique
Les limitations de cette technique comprennent: (1) il est nécessaire d'injecter la solution agent de casting immédiatement après sa préparation comme elle va épaissir rapidement après le catalyseur est ajouté; (2) l'agent de casting remplit vaisseaux grande conductance facilement, mais il ne combler avec fiabilité des navires plus petits, comme les artérioles (vaisseaux de résistance) et capillaires (vaisseaux nutritifs) et (3), il n'est pas le meilleur contraste radio-opaque pour les micro-imagerie CT, bien que certains groupes préfèrent Microfil pour les micro-imagerie CT 1,6. Cependant, suivant les suggestions proposées ci-dessus, y compris le placement d'aiguilles, la position du navire et la pression de perfusion, casting complet de navires plus petits peuvent être atteints. L'adaptabilité aux divers outils d'analyse rend cet agent un outil précieux pour analyser la structure vasculaire cérébral, y compris la circulation artérielle et veineuse, avec diversesperspectives.
Applications de la technique
L'avantage de cette méthode est son potentiel d'application large. Le casting se remplit tous les navires, y compris les artères, veines et capillaires de tous les tissus dans le corps, donc des structures vasculaires dans de multiples organes de différentes espèces peuvent être analysés. Auparavant, d'autres groupes ont utilisé cette perfusion pour les grands et les petits 7 8 navires dans les humains, de singes 9, 10 moutons, rats 4,11,12, et d'une souris 3,13. Nous allons maintenant montrer des preuves de l'utilisation de cette technique dans l'analyse de la structure des microvaisseaux du cerveau de souris, dans les états sains et malades 2. En outre, il existe des solutions avec des viscosités différentes Microfil disponibles pour perfuser les bateaux de différentes tailles et différentes couleurs pour améliorer la visualisation des vaisseaux dans divers organes. Par exemple, le rouge peut être facilement visualisés dans le parenchyme cérébral pâle, jaune et contraste bien avecrouge foncé myocarde. Par ailleurs, comme le matériel est radio-opaque, la vascularisation peut être visualisé avec la micro-tomographie à obtenir une image 3D orientable. Le tissu peut également être utilisé pour des sections de paraffine et de l'analyse histologique après avoir été imagée.
Conclusion
Nous démontrons ici un protocole pour faire un casting vasculaires des vaisseaux sanguins du cerveau de souris adultes, qui peuvent être adaptées en utilisant une variété de techniques d'analyse pour étudier la structure morphologique de la cerebrovasculature. Nous avons également fourni des preuves pour l'application de cette méthode à un modèle de l'état de maladie BAVM, représentée par élargie, les vaisseaux de forme irrégulière que le sang du shunt artériel circulations veineuse. Il existe une variété de méthodes de coulée vasculaires disponibles. Le protocole simple que nous fournissons ici pour un casting vasculaire peut être utilisé comme un outil pour examiner les vaisseaux sanguins du cerveau de souris adultes en utilisant différentes modalités d'imagerie.
Disclosures
Les procédures expérimentales pour l'utilisation des animaux de laboratoire ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel Utilisation de l'Université de Californie, San Francisco (UCSF).
Acknowledgments
Les auteurs remercient Voltaire Gungab de l'aide pour la préparation des manuscrits. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de: la National Institutes of Health (T32 GM008440 à EJ Walker, R01 NS27713 à WL Young, P01 NS44155 à WL Young et H. Su) et R21 NS070153 à H. Su et de l'American Heart Association (AHA 10GRNT3130004 à H. Su).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
References
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