Summary
この記事では、我々は実行しやすいとイメージに成体マウスの脳の血管ツリーを利用することができる脳血管キャスティングのためのシンプルで実用的なテクニックを紹介。
Abstract
血管イメージングは、脳動静脈奇形（BAVMs）などの脳血管疾患の臨床診断と管理に不可欠です。動物モデルは、脳血管疾患の病因論と潜在的な治療法を研究するために必要です。大動物用のイメージング血管系は比較的簡単です。しかし、マウスの脳の疾患モデルの血管撮像法を開発することにより、遺伝子組み換えマウスのラインのコストと可用性のが望ましい。イメージングは、マウス脳血管ツリーが課題です。人間と大きな動物、大血管での脈管構造学を評価するためのゴールドスタンダードでは（コンダクタンス）のレベルは、X線カテーテルコントラストベースの血管造影、小型げっ歯類には適していない方法です。
この記事では、我々は多くのdを使用して分析することができます動脈、静脈、毛細血管を含む、全体の血管床の耐久性のあるスケルトンを生成する脳血管キャスティングの手法を提案ifferentモダリティ。マウスcerebrovasculatureの微小血管の完全な鋳造が困難になる可能性がありますが、これらの課題は、このステップバイステップのプロトコールで対処されています。血管鋳造材料の心臓内の血流を介して、身体の全ての船舶は、キャストされています。脳を除去し、有機溶剤サリチル酸メチルを用いて明らかにすることができる。脳血管の三次元画像は、任意の従来の明視野顕微鏡や解剖顕微鏡で簡単にかつ安価に視覚化することができます。キャストcerebrovasculatureもイメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）1を用いて定量することができる。さらに、撮像された後、鋳物の脳は、組織学的分析のためのパラフィンに埋め込むことができます。
他の技術と比較して、この血管鋳造法の利点は、CTが原因で放射線不透過性の特性にスキャン、明視野顕微鏡分析など、さまざまな分析ツール、へその広範な適応です。材料だけでなく、組織学的および免疫組織化学的分析のteristic。組織のこの効率的な使用は、動物の使用量を節約し、コストを削減することができます。我々は最近、顕微鏡レベル2で成人BAVMのマウスモデルにおける不規則な血管を可視化し、マイクロCTスキャンによって撮像された不正な形式の船舶の追加のイメージを提供するために、この方法の応用を実証している。この方法は欠点を持っていると分析のすべてのタイプの理想的ではないかもしれないが、それは容易に学習し、広く体全体の血管の血管鋳造に適用することができる、シンプルで実用的なテクニックです。
Protocol
1。血管から血をクリア
- 0.25mlの生理食塩水で希釈した10 mg / kgのキシラジンでは100 mg / kgケタミンの腹腔内注射によってマウスを麻酔。
- 一旦麻酔が足のピンチに反応しないことが確認されて、横隔膜を切って、ちょうどxyphoidプロセス下にはさみで胸に切開を行い、胸腔を公開するために、胸郭の背側と腹側のセグメントの間にカットするはさみを使用してください。胸骨と止血剤と隣接胸壁とのセキュアを折り畳むことにより心臓を公開。心臓を露出するためにピンセットで心膜嚢を開きます。
- 流出で鈍22ゲージの針を持つ℃、チューブ37の湯浴でPBSを加えたヘパリン（5単位/ ml）溶液を温めるに接続されている（圧力を100mmHg）灌流ポンプをオンにします。
- 心尖付近に、左心室に針を挿入します。すぐに私は血まで、全身の血液の流出を有効にして、フラッシュを継続するために右心房を切開sは、循環から除去。
2。血管系へのキャスティングエージェントの灌流
- ミックスフィルタリングMVの化合物を4 mlとMV希釈剤を5ml：Microfil（フローテック株式会社カーバー、MA）製造業者のプロトコルごとにキャスティング溶液を調製します。触媒の450μlを（5％）（MV硬化剤）を追加します。解決策作業時間は20分ですが、適切な粘度を確保するために使用直前に混ぜる。
- 10mlのシリンジに剤溶液をキャスト撤退、注射器に鈍20ゲージの針を添付し、ソリューションを使用してニードルを埋める。
- 血液を洗い流すために使用されるのと同じ穴から左心室に針を挿入する。心臓に対する止血クランプのある場所に針を固定します。
- 約3ml /分で徐々に左心室に鋳造剤溶液を注入。過剰な圧力がキャスティングエージェントまたは潜在的な血管の破裂の誤った流れにつながる可能性があります。
- キャストの可視化：を含む成功した灌流の徴候を探します腸と肝臓の血管系におけるING剤、遠位四肢の変色、及び鼻と舌の変色。適切な灌流を達成するために必要に応じてニードルを再調整します。
3。組織の収集と処理
- 4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒドで脳と場所を削除℃に
- 直接室温でますます集中してエタノールにパラホルムアルデヒドから配置することによって、脳を脱水：25％エタノール、1日、50％エタノール、1日、75％エタノール、1日95％エタノール、2日間、および100％エタノール、2日間。
- 室温で2日間、サリチル酸メチルで灌流脳を浸漬することにより、血管周囲の脳組織を明確にする。
- 全体unsectioned明らかに脳の血管系は、解剖顕微鏡（図1）（ライカMZFL III顕微鏡、ライカマイクロシステムズ、バノックバーン、イリノイ州）または明視野顕微鏡（図2）（ライカDM /下サリチル酸メチルに浸漬、脳で画像化することができますLS、ライカマイクロシステムズ）。
- Reclarification組織が完全にクリアされていない場合に行うことができます。 2日間サリチル酸メチル、2日間、95％エタノールへの転送の脳、2日間100％のエタノール、およびサリチル酸メチルから。
4。マイクロCTイメージングまたは組織学的応用 - 組織の準備
- 脳は、直接（図4）明確化した後または、再水和後のマイクロCTを用いて画像化することができます。
- 組織学的分析のために脳組織を準備するには、シリアル化後EtOHを介して脳を再水和する：100％エタノール、1日95％エタノール、1日、75％エタノール、1日、50％エタノール、2日間、25％エタノール、2日間、PBSでと店舗。脳は、標準的な手順を用いてパラフィンに包埋することができます。
5。代表的な結果
血管キャスティングに続いて、cerebrovasculatureは、脳の表面（図1A）に肉眼的に見ることができます。実質内の血管ツリーを可視化し、以下の明確化（図1B）ことができます。詳細な血管構造イメージングと（図3）範囲を解剖し、マイクロCTスキャン（図4）で、明視野顕微鏡（図2）で分析することができます。明視野顕微鏡を使用して、血管系は、脳（図2A）と同様に高い倍率（図2B）で個々の微小血管の切削することなく異なる焦点面で見ることができます。解剖範囲の下で、一つはcerebrovasculatureの三次元構造（図3）のよりよい視覚化を可能にする、1つの焦点面で全体の血管構造を見ることができます。解剖顕微鏡下で撮影された画像は、大血管の形態および全脳の血管系を示すが、明視野顕微鏡（図2B）で撮影した画像に示されている詳細情報が不足していることができる。この手法は、我々の実験BAVMの大人のマウスモデル2で不規則な血管を検出することができました。図5は、マイクロCTスキャン（図5A）および明視野顕微鏡（図5B）によって検出された同じ不規則な船の例を示しています。一緒に、このデータは、我々はtを分析することができることを示しています血管鋳造後の複数のイメージングツールと彼は同じサンプル。
図1。血管キャスティング以下の全マウスの脳。前（A）と溶剤サリチル酸メチルによる（B）明確化の後に。血管は、脳の表面（A）にし、実質、以下の明確化の手順（B）で明確に可視化することができます。
明らかに血管鋳造脳の図2。明視野顕微鏡像。脳は様々な面で、異なる倍率のレベルで画像化することができます。スケールバー200μmの（）と50μmの（B）。
図3。背側から全体の成体マウスの脳のcerebrovasculatureを示す1倍で顕微鏡画像を解剖。
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図4マイクロCTは背側から図3に示すように、同一の全体の大人のマウスの脳の画像をスキャンする。
図5。脳動静脈奇形を検出するために血管の鋳造法の応用。 A）血管鋳造脳のマイクロCTスキャンでは、腹側のビューから、右半球の拡大、不規則なAVMのような血管の領域を示しています。地域の拡大画像（白いボックス）が右側に表示されます。 B）同じ不規則な血管は、50倍の倍率での明視野顕微鏡下で可視化した。スケールバーは50μm。
Discussion
ここでは、さまざまなモダリティで撮像される成体マウスのcerebrovasculatureの鋳造のための方法を報告する。疾患モデルBAVMにこのメソッドのアプリケーションは、不規則な血管の3次元解析が可能になります。潜在的な将来の研究では、マイクロCT画像の定量化、組織の組織学的分析、および血管疾患の進行の診断が含まれています。
一般的に発生する問題と提案
脳血管系の完全な血流が常に満たされるわけで。左心房や大動脈を破裂させずに遠位血管に到達するのに十分な圧力を有することは重要な問題です。これを克服するために、約100mmHgの一貫性のある圧力を適用する。また、大動脈にエージェントをキャストの適切な流出を確実にするために針位置を調整する。キャスティングエージェントは、脳の血管に到達できるように頸動脈が制限されていないことが重要です。あたりの改善小血管と相関する重要な手順融合は、以下のとおりです。血管から血液の（1）適切なクリアリング、鋳造剤の（2）ろ過、および鋳造剤注入時（3）針の配置。ケアは、左心房と肺にエージェントを鋳造の注入を避けるために注意すべきである。他の研究者が成功し、追加の手順を使用せずに、マウス3とラット4 cerebrovasculatureを灌流している。 hemotoxylinは93％の血管内腔の血流5を示したとMicrofil灌流血管の手動分析の対比。常に破棄または完全にそれはすぐに重合し、そしてツールは複数の被験者のために使用することはできないとして鋳造剤と接触する任意のツールをきれいに。周囲のマウスの脳組織の明確化が困難な場合があります。サリチル酸メチルの浸漬の後、組織は、依然として血管のイメージングが困難、不透明表示されることがあります。適切な脱水と明確化を確保することがこの問題を解決する必要があります。アルコールとメチルの中にロッカーの脳組織を配置するalicylateの治療は、組織の明確化を向上させることができます。
技術の欠点
この手法の限界は、（1）それはすぐに触媒を添加した後、それはすぐに濃くなるので、それを混合した後、鋳造剤溶液を注入することが必要であること、（2）キャストのエージェントは、容易に大きなコンダクタンスの船を埋め、そうではありません確実にこのような細動脈（抵抗血管）と毛細血管（栄養血管）などの小型船を、塗りつぶし、およびいくつかのグループは、マイクロCTイメージング1,6のためにMicrofilを好むものの、（3）それは、マイクロCTイメージングに最適なX線造影ではありません。しかし、適切な針の配置、船の位置と灌流圧を含む上記の提案の提案、以下、小血管の完全なキャスティングを実現することができます。様々な解析ツールへの適応性は、様々で、このエージェントは動脈と静脈の循環を含めて、脳の構造を分析するための貴重なツールとなります視点。
技術のアプリケーション
この方法の利点は、その広範な応用の可能性があります。キャストは動脈、静脈、および本体内のすべての組織の毛細血管を含むすべての船舶を、いっぱいになる、様々な種の複数の臓器の血管構造を解析するため。以前、他のグループは、ヒト、サル9、羊10、ラット4,11,12、およびマウスの3,13の7大と小型の8隻は、この血流を使用している。我々は現在、健康と病気の状態2の両方で、マウスの脳内微小血管の構造を解析する上でこの技法を使用しての証拠を示しています。さらに、様々な臓器の血管の可視化を向上させるためにさまざまなサイズと異なる色の血管を灌流するために、様々な粘度とMicrofil解決方法があります。例えば、赤は淡い脳実質に容易に可視化すること、および黄色のコントラストもでできます。暗赤色心筋。また、材料が放射線不透過性であるため、血管系は、マイクロCTは、3D回転可能な画像を得るためにスキャンで撮像することができます。組織はまた、撮像された後パラフィン切片と組織学的分析に使用することができます。
結論
我々はここにcerebrovasculatureの形態学的構造を研究するために分析の様々な技法を用いて適応することができます成体マウスの脳の血管の血管鋳型を作るためにプロトコルを示す。我々はまた、動脈から静脈循環へシャント血その拡大、不規則な形状の容器に代表される、BAVMの疾患の状態のモデルにこの方法の応用のための証拠を提供している。利用可能な血管の鋳造方法には、さまざまなものがあります。我々は血管鋳型のためにここに提供するシンプルなプロトコルは、様々な画像診断法を用いて成体マウスの脳の血管を調べるためのツールとして使用することができます。
Disclosures
実験動物を使用するための実験手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（UCSF）の動物実験使用の委員会によって承認された。
Acknowledgments
著者は、原稿の準備の支援についてヴォルテールGungabに感謝。この作品は、からの助成金によって部分的にサポートされていました：H.蘇に国立衛生研究所（T32 GM008440 WLヤングとH.蘇へEJウォーカー、WLヤングにR01 NS27713、NS44155 P01へ）、およびR21 NS070153、とアメリカ人心臓協会（H. suのAHA 10GRNT3130004）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
References
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