Cerebrovaskulära Gjutning av de vuxna mus för 3D-avbildning och morfologisk analys

Summary

I denna artikel presenterar vi en enkel, praktisk teknik för cerebrovaskulära gjutning som är lätt att utföra och kan utnyttjas för att bilden vaskulära trädet av den vuxna musen hjärnan.

Abstract

Blodkärl avbildning är avgörande i den kliniska diagnosen och hantering av cerebrovaskulära sjukdomar som hjärnan kärlmissbildningar (BAVMs). Djurmodeller är nödvändiga för att studera etiopathology och möjlig behandling av cerebrovaskulära sjukdomar. Imaging kärlsystemet i stora djur är relativt lätt. Dock utvecklar fartyg avbildningsmetoder för musmodeller hjärnsjukdom önskvärt på grund av kostnaderna och tillgången på genetiskt modifierade möss linjer. Imaging de murina cerebral vaskulär träd är en utmaning. Hos människor och större djur, den gyllene standarden för att bedöma angioarchitecture på makrovaskulär (konduktans) nivå är x-ray kateter kontrast-baserad angiografi, en metod som inte lämpar sig för små gnagare.

I denna artikel presenterar vi en metod för cerebrovaskulär gjutning som ger en slitstark skelett av hela kärlbädd, inklusive artärer, vener och kapillärer som kan analyseras med hjälp av många different modaliteter. Komplett gjutning av mikrokärl av musen cerebrovasculature kan vara svårt, men är dessa utmaningar behandlas i detta steg-för-steg-protokollet. Genom intrakadriell perfusion av vaskulära gjutning material, alla fartyg i kroppen gjutna. Hjärnan kan då tas bort och förtydligas med hjälp av organiska lösningsmedel metylsalicylat. Tredimensionell avbildning av fartygen hjärnan blodet kan visualiseras enkelt och billigt med konventionella brightfield mikroskop eller dissekera mikroskop. Den gjutna cerebrovasculature kan också avbildas och kvantifieras med hjälp av mikro-datortomografi (mikro-CT) ^1. Dessutom, efter att avbildas kan gjuten hjärnan vara inbäddade i paraffin för histologisk analys.

Fördelen med detta vaskulär gjutmetod jämfört med andra tekniker är dess breda anpassning till olika analytiska verktyg, inklusive brightfield mikroskopisk analys, datortomografi på grund av den röntgentäta egenskaperteristic av materialet, samt histologiska och immunhistokemiska analyser. Denna effektiv användning av vävnad kan rädda djur användning och minska kostnaderna. Vi har nyligen visat tillämpning av denna metod för att visualisera den oregelbundna blodkärlen i en musmodell av vuxna BAVM på en mikroskopisk nivå ^2, och ge ytterligare bilder av missbildade fartyg avbildas av mikro-CT. Även denna metod har nackdelar och kanske inte idealisk för alla typer av analyser, är det en enkel, praktisk teknik som lätt kan läras och i stor utsträckning för vaskulär gjutning av blodkärlen i hela kroppen.

Protocol

1. Clearing Blod från kärlsystemet

1. Bedöva musen genom intraperitoneal injektion på 100 mg / kg ketamin med 10 mg / kg xylazin utspädd i 0,25 ml koksaltlösning.
2. När bedövningen har bekräftats av inget svar på en tass nypa, använda sax för att göra ett snitt över bröstet med en sax strax under xyphoid processen skär genom membranet, och skär upp mellan rygg-och ventrala delen av bröstkorgen för att exponera brösthålan. Exponera hjärta genom att fälla upp bröstbenet och angränsande bröstkorgen och säkra med hemostat. Öppna hjärtsäcken med pincett för att exponera hjärtat.
3. Slå på perfusion pumpen (100 mmHg tryck) som är anslutna till varma PBS plus heparin (5 enheter / ml) i varmt vattenbad vid 37 ° C och rör med ett trubbigt 22 gauge kanyl på utflödet.
4. Stick in nålen i vänster kammare, nära spetsen av hjärtat. Omedelbart skar upp höger förmak för att systemiska blod utflöde och fortsätt skölja tills blodet is ur omlopp.

2. Perfusion av Gjutning ombud i kärlsystemet

1. Förbered Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) gjutning lösning per tillverkarens protokoll: Blanda 5 ml MV spädningsvätska med 4 ml filtrerat MV förening. Tillsätt 450μl (5%) av katalysator (MV härdare). Lösning arbetstid är 20 minuter, men blanda omedelbart före användning för att säkerställa korrekt viskositet.
2. Dra casting agent lösningen till en 10 ml spruta, bifoga en trubbig 20 nål till sprutan och fyll nål med lösning.
3. In kanylen i vänster kammare genom samma hål som används för spolning blodet. Säkert nål på plats med hemostat klämma på hjärtat.
4. Injicera lösningen casting agent långsamt i vänster kammare vid ca 3 ml / min. Övertryck kan leda till felaktiga flödet av gjutning agent eller potentiell kärl brista.
5. Leta efter tecken på en framgångsrik perfusion, inklusive: visualisering av gjutnaning agent i tarmen och levern kärlsystemet, distala extremiteterna missfärgning, och näsa och tunga missfärgning. Justera nålen om det är nödvändigt för att uppnå god perfusion.

3. Insamling och bearbetning av Tissue

1. Ta bort hjärnan och placera i 4% paraformaldehyd över natten vid 4 ° C.
2. Torka hjärnan genom att placera från paraformaldehyd direkt in i allt mer koncentrerad EtOH i rumstemperatur: 25% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 2 dagar, och 100% EtOH, 2 dagar .
3. Klargör hjärnvävnad runt blodkärl genom att sänka ner perfusion hjärnan i metylsalicylat i 2 dagar i rumstemperatur.
4. Vaskulatur av hela förtydligas unsectioned hjärnan kan avbildas med hjärna nedsänkt i metylsalicylat under ett dissekera mikroskop (Fig. 1) (Leica MZFL III mikroskop, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) eller brightfield mikroskop (Fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems).
5. Reclarificationkan göras om vävnaden inte är helt raderas. Från metyl salicylat, överföring hjärna till 95% EtOH i 2 dagar, 100% EtOH för 2 dagar, och metylsalicylat i 2 dagar.

4. Micro-CT eller histologiska Programspecifika Tissue Förberedelser

1. Hjärnan kan avbildas med en mikro-CT direkt efter förtydligande eller efter re-hydrering (bild 4).
2. För att förbereda hjärnvävnad för histologisk analys, rehydrera hjärnan via seriell utspädd EtOH: 100% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 2 dagar, 25% EtOH, 2 dagar , och förvara i PBS. Hjärnan kan sedan bäddas in i paraffin med en vanlig procedur.

5. Representativa resultat

Efter vaskulär gjutning kan cerebrovasculature ses makroskopiskt på hjärnan yta (Fig.1A). Den vaskulära träd inne i parenkymet kan visualiseras följande förtydligande (bild 1B). Den detaljerade vaskulära strukturkan avbildas och analyseras under ett brightfield mikroskop (Fig. 2), dissekera omfattning (Figur 3), och med mikro-CT skanning (bild 4). Använda brightfield mikroskopi kan kärlsystemet ses på olika fokalplan utan sektionering hjärnan (Fig. 2A) samt enskilda mikrokärl vid högre förstoring (Fig. 2B). Enligt en dissekera omfattning, kan man se hela vaskulär struktur i ett fokalplan, vilket möjliggör bättre visualisering av den tredimensionella strukturen av cerebrovasculature (Fig. 3). Bilder som tagits under en dissekera mikroskop kan visa stort fartyg morfologi och hela hjärnan kärlsystemet, men saknar detaljer som visas i bilder tagna med brightfield mikroskopi (Fig. 2B). Denna teknik har gjort det möjligt för oss att upptäcka oregelbunden fartyg i våra experimentella BAVM vuxen musmodell ^2. Figur 5 visar ett exempel på samma oregelbundna fartyg som upptäcks med mikro-CT-skanning (fig. 5A) och brightfield mikroskop (Fig. 5B). Tillsammans visar dessa data att vi kan analysera than samma prov med flera bildframställning efter vaskulär gjutning.

Figur 1. Hela musen hjärnan efter vaskulär gjutning. Före (A) och efter (B) Förtydligande av metylsalicylat lösningsmedel. Fartyg kan tydligt visualiseras på hjärnan ytan (A) och i levervävnad följande förtydligande förfarande (B).

Figur 2. Brightfield mikroskop bilder av förtydligas gjutna vaskulära hjärnan. Hjärnan kan avbildas på olika plan och på olika förstoringsgrader. Skala Bar 200μm (A) och 50μm (B).

Figur 3. Analysera mikroskop bild på 1x som visar hela den vuxna cerebrovasculature musen hjärnan från en rygg-vy.

<img alt = "Bild 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" />
Figur 4. Micro-CT skanning bild av samma helhet vuxen mus hjärnan visas i figur 3 från en rygg-vy.

Figur 5. Tillämpning av vaskulär gjutning metod för att upptäcka en hjärna arteriovenös missbildning. A) Micro-CT-scanning av vaskulära gjutet hjärnan visar regionen förstoras, oregelbunden AVM-liknande fartyg i högra hjärnhalvan från en ventral vy. Förstorad bild av regionen (vita rutan) visas till höger. B) Samma oregelbundna fartyg visualiseras i brightfield mikroskop vid 50x förstoring. Skala bar 50 ìm.

Discussion

Vi redovisar här en metod för gjutning av vuxna musen cerebrovasculature som kan vara avbildade med olika modaliteter. Tillämpningen av denna metod för att sjukdomen modell BAVM möjliggör 3D-analys av oregelbunden fartyg. Potentiella framtida studier inkluderar kvantifiering av mikro-CT-bilder, histologisk analys av vävnader, och diagnos av vaskulär sjukdomsprogression.

Vanliga Problem och förslag

Komplett genomblödning av hjärnan kärlsystemet är inte alltid uppnås. Efter att ha tillräckligt tryck för att nå den distala blodkärl utan att sprängas sönder vänster förmak eller kroppspulsådern är en utmaning. För att lösa detta, tillämpas konsekvent tryck på ca 100 mm Hg. Också, justera nålen för att säkerställa lämplig utflöde av gjutning agent i aorta. Det är viktigt att halspulsåder inte är begränsade så att gjutningen agent kan nå hjärnan fartyg. Kritiska rutiner som korrelerar med förbättrad små fartyg perfusion är: (1) korrekt clearing av blodet från kärlsystemet, (2) filtrering av gjutning ombud, och (3) nål placering under gjutningen agent injektion. Försiktighet bör vidtas för att undvika injektion av casting agent in i vänster förmak och lunga. Andra forskare har framgångsrikt perfusion mus ³ och råtta ⁴ cerebrovasculature utan ytterligare förfaranden. Manuell analys av Microfil perfusion fartyg counterstained med hemotoxylin visade 93% fartyget lumen perfusion ^5. Alltid kasta eller helt ren något verktyg som kommer i kontakt med casting agenten som det kommer polymeriserar snabbt och verktyg kan inte användas för flera ämnen. Förtydligande av den omgivande musen hjärnvävnad kan vara en utmaning. Efter nedsänkning i metylsalicylat kan vävnaden verkar fortfarande oklara, vilket gör fartyget avbildning svårt. Säkerställa god uttorkning och förtydligande bör lösa detta problem. Placering hjärnvävnad på en rocker under alkohol och metyl salicylate behandling kan förbättra vävnad förtydligande.

Nackdelar med tekniken

Begränsningarna av denna teknik är: (1) är det nödvändigt att injicera lösningen casting agenten omedelbart efter blandning det som det kommer tjocknar snabbt efter katalysatorn läggs, (2) gjutning agenten fyller stora konduktans fartyg lätt, men inte tillförlitligt fylla mindre fartyg, som arterioler (motstånd fartyg) och kapillärer (närande fartyg), och (3) det är inte den bästa röntgentäta kontrast för mikro-CT, men vissa grupper föredrar Microfil för mikro-CT ^1,6. Efter förslagen föreslås ovan, inklusive korrekta nål placering, båtens position och perfusion tryck, kan slutföra gjutning av mindre fartyg uppnås. Den anpassningsförmåga till olika analysverktyg gör detta agenten ett värdefullt verktyg för att analysera cerebrovaskulära struktur, inklusive arteriella och venösa cirkulationen, med olikaperspektiv.

Tillämpningar av tekniken

Fördelen med denna metod är dess breda tillämpning potential. Den gjutna fyller alla fartyg, inklusive artärer, vener och kapillärer av alla vävnader i kroppen, så vaskulära strukturer i flera organ av olika arter kan analyseras. Tidigare har andra grupper använt denna perfusion för stora ⁷ och små ⁸ fartyg i humant, apa ^9, får ^10, råtta ^4,11,12 och mus ^3,13. Vi visar nu tecken på att använda denna teknik för att analysera strukturen av mikrokärl i musen hjärnan, både hos friska och vid olika sjukdomar ^2. Dessutom finns det Microfil lösningar med olika viskositet tillgängliga för BEGJUTA fartyg av olika storlekar och olika färger för att förbättra visualisering av fartyg i olika organ. Exempelvis kan röda enkelt visualiseras i den bleka hjärnparenkymet och gult kontrasterar väl medmörkröd hjärtmuskeln. Eftersom materialet är röntgentäta kan kärlsystem avbildas med mikro-CT scanning för att få en 3D-roterande bild. Vävnaden kan även användas för paraffin och histologiska analys efter som avbildas.

Slutsats

Vi visar här ett protokoll för att göra en vaskulär avgjutning av blodkärlen i den vuxna musen hjärnan, som kan anpassas med hjälp av olika analysmetoder för att studera morfologiska struktur cerebrovasculature. Vi har också lagt fram bevis för tillämpningen av denna metod för att en modell av BAVM sjukdomstillstånd, företrädd av förstorad, oregelbundet formade fartyg som shunt blod från arteriella till venös upplagor. Det finns en mängd olika vaskulär gjutning metoder som finns tillgängliga. Den enkla Protokollet ger vi här för en vaskulär gjutna kan användas som ett verktyg för att undersöka kärlsystemet av den vuxna musen hjärnan med hjälp av olika avbildningsmetoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microfil	FlowTech	MV130	4 month shelf life
Methyl Salicylate	Fisher Scientific	O3695-500	to clarify tissue