Summary
يوصف أسلوب لإعداد مصفوفة الأبعاد 3-تتكون من نوع الكولاجين الأول والخلايا الليفية الإنسان الأساسية. هذا جل عضوي النمط بمثابة الركيزة مفيدة لتقييم الغازية الهجرة الخلية لأنه يحاكي السمات الأساسية للأنسجة سدى، وهي قابلة للكثير من أشكال المجهري.
Abstract
الهجرة الخلية الأساسية لكثير من جوانب علم الأحياء، بما في ذلك الشفاء التنمية الجرح، والاستجابات الخلوية في الجهاز المناعي، وورم خبيث من خلايا الورم. وقد درس الهجرة على coverslips الزجاج من أجل جعل ديناميات الخلوية قابلة للتحقيق من قبل المجهر الضوئي. ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح أن العديد من جوانب الهجرة الخلية تعتمد على ملامح البيئة المحلية بما في ذلك مرونته، وتكوين البروتين، وحجم المسام، والتي لا تمثل بأمانة من ركائز صلبة 2 الأبعاد مثل الزجاج والبلاستيك 1. وعلاوة على ذلك، فقد تبين التفاعل مع أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخلايا الليفية اللحمية (2) والخلايا المناعية 3، لتلعب دورا حاسما في تعزيز غزو الخلايا السرطانية. وقد أظهرت التحقيقات على المستوى الجزيئي على نحو متزايد أن ديناميات الجزيئية، بما في ذلك الاستجابة للعلاج المخدرات، من الخلايا متطابقة تختلف اختلافا كبيرا بالمقارنة
من الناحية المثالية، فإنه سيكون من الأفضل لدراسة الهجرة الخلية في سياقها التي تحدث بشكل طبيعي في الكائنات الحية، ولكن هذا ليس من الممكن دائما. نظم زراعة الأنسجة وسيطة، مثل مصفوفة الخلايا المشتقة، matrigel والثقافة عضوي النمط (الموصوفة هنا) إإكسبلنتس الأنسجة، organoids، والأعضاء المستمدة من الحيوانات، ولذلك فإن وسيطة التجريبية الهامة. هذه الأنظمة بعض جوانب التقريبي لفي الجسم الحي ولكن البيئة هي أكثر قابلية للتلاعب التجريبية مثل استخدام خطوط الخلايا ثابت بالنقل، ونظم العلاج من تعاطي المخدرات، على المدى الطويل والتصوير عالية الدقة. نظم وسيطة مثل هذه مفيدة خاصة أن تثبت الأسباب للتحقق من صحة تحقيقات ووضع معايير المطلوبة لصورة الاستجابة الديناميكية للخلايا وصحفيين الفلورسنت قبل إجراء التصوير في الجسم الحي 5. على هذا النحو، فإنها يمكن أن تؤدي دورا هاما في الحد من الحاجة لإجراء تجارب على يفينز الحيوانات.
Protocol
1. إنشاء الثقافات الخلايا الليفية من الجلد إإكسبلنتس
- توضع 4 مم الخزعات كمة تم الحصول عليها من الساعد الإنسان في MEM استكمال 100 وحدة / مل البنسلين، 100 الستربتوميسين ميكروغرام / لتر، و 0.25 ميكروغرام / مل Fungizone.
- تقليم أي الدهون تحت الجلد ودقة ختم خزعة الى قطع صغيرة بواسطة هزاز رقم 24 شفرة مشرط ضد الجزء السفلي من طبق بتري.
- وأضاف المركز في الطين الأنسجة من 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة مع وسائل الإعلام نمو الخلايا الليفية الأولية (MEM تستكمل مع FCS 10٪، 100 وحدة / مل البنسلين، 100 الستربتوميسين ميكروغرام / لتر، و 25 ميكروغرام / مل Fungizone) حتى سطح القارورة هي لكن عمق السائل تغطية غير كافية لأنسجة لتعويم.
- بعد 3 أيام الحضانة عند 37 درجة مئوية في جو من مرطب 5٪ CO 2، 3 مل من إضافة وسائل الإعلام نمو الخلايا الليفية الأولية.
- بعد أيام آخر الحضانة وسائل الإعلام تغيير 3 مع وسائل الإعلام الطازجة الأولية نمو الخلايا الليفية، أو إذا سلLS هي متموجة تقريبا ويمكن تقسيم وسائل الاعلام في أنهم 1:04 الطازجة. (يمكن حذف Fungizone من هذه اللحظة فصاعدا).
2. المرحلة الأولى - إعداد الكولاجين I ذيول الفئران من
ملاحظة: بروتوكول لحوالي 12-14 ذيول الفئران المراهقين (الطازجة أو المجمدة)
- إعداد ذيل الفئران عن طريق الغسيل في الايثانول 70٪ وإزالة الأوتار على النحو التالي:
- إزالة الجلد من ذيل الفئران عن طريق تشريح في منتصف الذيل من أعلى إلى أسفل مع. مشرط وتدوي على طول الذيل
- فصل وتر من صميم المنطقة القريبة من الذيل.
- إزالة وتر تجاه المنطقة البعيدة من الذيل تجنب استخدام الملقط وغمد مسننة.
- 1 غرام من استخراج وتر / 250 مل من حمض الخليك 0،5 M من التحريك وعلى C ° 4 لمدة 48 ساعة.
- أجهزة الطرد المركزي لاستخراج (7،500 x ج) لمدة 30 دقيقة وتجاهل بيليه.
- إضافة حجم مساو من 10٪ (W / V) كلوريد الصوديوم لطاف، ويحرك المزيج لمدة 30-60 دقيقة.
- Dialyze الحل الكولاجين ضد التغييرات 6-8 من 6L ~ 17،5 حمض الخليك ملي (1 مل حمض الخليك الجليدي لكل لتر من الماء البارد، وتغير 2 × يوميا).
- أجهزة الطرد المركزي في 30000 الكولاجين dialysed x ج لمدة 1.5 ساعة.
- إزالة طاف ومكان في قارورة معقمة.
- ضبط الكولاجين I تركيز على 2 ملغ ~ / مل باستخدام حمض 0،5 ملي الخليك في 4 درجات مئوية
3. المرحلة الثانية - إعداد مصفوفة 3D مع الخلايا الليفية مضمن (السماح للتعاقد لمدة 8 أيام).
- تجميع مزيج باستخدام الكواشف الباردة عند 4 ° C في زجاجة قبل مبردة. I حفاظ على الكولاجين على الجليد.
- لقارورة واحدة من الخلايا الليفية T75 الأولية متموجة (~ عدد الخلايا 1 × 10 6) الاستخدام:
- 25 مل الكولاجين ذيل الفئران (تقريبا اضرب 2mg/ml)
- 3 مل 10XMEM
- هيدروكسيد الصوديوم 0،22 M: أولا، إضافة 2ml، ثم الانقطاع عن الحكمة في حين التحريك، حتى يتحول الكولاجين البرتقال،
- ولكن ليس الوردي (عادة ما يصل إلى 3 مل). تقريبي ع H = 7.2.
- ملاحظة: من المهم للتأكد من أن متوسط / هلام يبقى محايدا أو الحمضية قليلا والخلايا الليفية لن ينكمش الجل إذا تعرضت لظروف قلوية حتى قليلا.
- Trypsinise في الخلايا الليفية، وتدور في 400 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
- خلال 5 دقائق تدور أعلاه: إعداد 12 × 35 ملم الأطباق البلاستيك - تحقيق العادة 12 أطباق من قارورة من الخلايا الليفية / مزيج الكولاجين.
- اعادة تعليق الخلايا الليفية في FCS مل 3 و إضافة إلى هذا المزيج على الفور الكولاجين ويحرك المزيج.
- لوحة ما يقرب من 2.5 مل من الكولاجين / الخلايا الليفية في طبق في أسرع وقت ممكن. في محاولة لتجنب فقاعات ووضع الكولاجين.
- السماح للالكولاجين وضعت في C ° 37 في جو من مرطب 5٪ CO 2 في الهواء لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 1ml من الخلايا الليفية تنموال وسائل الإعلام (DMEM + 10٪ FCS).
- فصل مادة الكولاجين / الخلايا الليفية من جوانب الطبق باستخدام ماصة.
- اليوم التالي: إضافة 1ml من وسائل الإعلام نمو الخلايا الليفية (FCS DMEM + 10٪).
- تغيير وسائل الإعلام كل يوم. تسمح الكولاجين / مصفوفة الخلايا الليفية إلى ما يقرب من عقد لمدة 8 أيام، حتى أنها تناسب في طبق بشكل جيد 24 (تقلص من الطول 3.5 ~ 1.5 سم لفي قطر، انظر الشكل 1).
ملاحظة: يجب أن يتم ضبط تركيز الكولاجين لتناسب التطبيق. أكثر تمييع الحل الكولاجين، فإن أسرع يتم التعاقد من قبل الخلايا الليفية. وسوف يكون من ذوي الخبرة اختلافات طفيفة في معدل الانكماش مع مجموعات مختلفة من الكولاجين في نفس التركيز. وبالمثل، والثقافات المختلفة الخلايا الليفية ستتعاقد المواد الهلامية الكولاجين بمعدلات مختلفة، وتقديم المزيد من الخلايا الليفية، وأسرع معدل انكماش. وبالتالي، يمكن تركيز وكثافة الخلايا الليفية الكولاجين من تعديلها لتعديل معدل الانكماش،والكثافة النهائية للهلام الكولاجين.
4. المرحلة الثانية - الخلايا تصفيح الفائدة على رأس المصفوفة
ملاحظة: تعقيم جميع المعدات وملقط مع الايثانول قبل الاستخدام.
- باستخدام ملقط حادة، نقل بلطف مصفوفة المتعاقد عليها إلى 24 جيدا الطبق. تأكد من أنه لا أضعاف.
- إعداد تعليق خلايا الفائدة عند ما يقرب من 4 1ML 10 × 4 / مل وصفيحة (بعد trypsinising، وتدور الخلايا للتخلص من التربسين) على رأس المصفوفة. والعدد الفعلي للخلايا اللازمة تختلف تبعا لنوع من الخلايا المستخدمة. يجب أن تكون طبيعية الخلية المتوسطة المتوسطة النمو للخلايا ذات الاهتمام.
- تسمح الخلايا لتنمو لالتقاء على رأس المصفوفة، ما يقرب من 3-5 أيام.
5. المرحلة الثالثة - نقل المصفوفة إلى الشبكة للغزو (حوالي 0-21 يوم)
- قطع شبكات الفولاذ المقاوم للصدأ لإنشاء ترايبود والأوتوكلاف قبل استخدامها (انظر الشكل 2).
- وضع شبكة العقيمة في6 طبق سم، إضافة الوسائط النمو إلى مستوى أعلى من الشبكة (تقريبا 10.5ml). مصفوفة مكان على الشبكة ونضح بلطف وسائل الإعلام حتى أسفل المصفوفة على اتصال مع وسائل الاعلام ولكن لا المغمورة. ويشار إلى هذا على أنه واجهة الهواء / السائل، مما يخلق التدرج التي تشجع الغزو. استبدال المتوسطة كل يومين (انظر الشكل 2).
- تعيش خلية، يمكن تصويرها باستخدام خلايا التصوير السياقية الفلورية في هذه المرحلة أو في وقت سابق. يمكن للالكولاجين المتعاقد عليها أو ييفي يمكن تصوير I باستخدام الجيل التوافقي الثاني (SHG، انظر الشكل 3). استخدام متعدد الفوتون الإثارة جنبا إلى جنب مع واسعة المجال نجد أن الكشف ولا يمكن تصوير SHG لا يقل عن 100 ميكرومتر في مصفوفة، في حين ولا يمكن تصوير الخلايا معربا عن GFP حشوية لا يقل عن 200 ميكرون عميقة.
ملاحظة: فيما يتعلق الكمي للغزو، وهو اليوم الذي توضع matricies على شبكات يحدد يوم 0. التنسيب على شبكات الانحدار يولد من وسائل الإعلام التي تروج ثقافة الخلية الباحث الغزو يا المصفوفة. ولا يمكن تصوير عينات على مدى 1 التالي - 21 يوما (أو أكثر) لتقييم العمليات البيولوجية مثل غزو بقاء والانتشار أو التفريق (انظر قائمة المراجع).
6. المرحلة الرابعة - التثبيت
- إضافة 5 مل من PFA 4٪ في أنبوب فالكون.
- نقل المصفوفة على سطح مستو. قطع في نصف المصفوفة مع مشرط نظيفة جديدة (كما تكونوا تلطيخ المقطع العرضي)، ورفع المصفوفة مع مشرط ونقل إلى PFA 4٪، وإصلاح أكثر من ليلة.
- المصفوفات عضوي النمط الآن على استعداد لوصمة عار مع الأجسام المضادة / وصمة عار في الاختيار (انظر الشكل 3).
7. ممثل النتائج:
الشكل 1 مثال على الخلايا الليفية المتعاقدة مع الكولاجين خليط من الخلايا الليفية I. والفئران الكولاجين الذيل بعيدة عن طبق بتري وسمح للتعاقد على 6-8 أيام.
الشكل 2 "SRC =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/>
الشكل 2 تطور عضوي النمط الفحص. A التخطيطي، من مجموعة يصل عضوي النمط والتقدم. B، مثال على الكولاجين / مصفوفة الخلايا الليفية على رأس من الفولاذ المقاوم للصدأ، شبكة العقيمة لإنشاء الهواء / واجهة السائل.
الشكل 3 تطبيقات الفحص عضوي النمط. A، B البنكرياس القنوي غير الغازية والغازية غدية (PDAC) الخلايا الغازية مع مرور الوقت مع مصفوفة عضوي النمط. C، ما يعادل يعيشون الجلد تظهر البشرة طبقية على مكون الخلايا الليفية الجلدية المتعاقدة مع كولاجيني. D، خلايا سرطان الجلد C8161 غزو الخلايا الليفية في ل التعاقد عن طريق الجلد، أي ما يعادل كولاجيني. E، الخلايا PDAC الغازية (الخضراء) والتفاعل مع الخلايا الليفية الغازية (الأحمر) داخل مصفوفة عضوي النمط. F
Discussion
هنا نقدم طريقة لإنتاج مصفوفة الأبعاد 3-مناسبة لدراسات الهجرة الخلية الغازية 6-8. المصفوفة يتكون من الألياف الكولاجين من النوع 1، والتي يتم التعاقد على مدى فترة من عدة أيام من الخلايا الليفية الأولية البشرة الإنسان. مستعدة الكولاجين من استخلاص الحمض، وليس الهضم الأنزيمية، الذي يحافظ على تفاعل في نهايات بولي ببتيد ويعزز عبر ربط الألياف الكولاجين في أكبر المجاميع على تحييد الظروف العازلة 9. وهذا يؤدي إلى هلام إعادة تشكيلها على نحو أوثق الذي يحاكي ملامح الكولاجين في الجسم الحي ولها عواقب مهمة بالنسبة لخصائص الغازية من الخلايا المستزرعة في المواد الهلامية. لا يهم ما إذا كان يتم استخدام المواد الطازجة أو المجمدة البداية، ولكن استخدام من ذيول الفئران المراهقين أمر مهم لأن الكولاجين عبر ربط أكثر عطوب في أصغر الحيوانات. I الكولاجين من الحيوانات الأصغر وبالتالي أسهل للاستخراج، وإعادة تشكل ثإيث أعلى الإخلاص.
يمكن ان تكون ثابتة في مادة الكولاجين وملطخة الأجسام المضادة الموجهة ضد خلايا الورم إما الغازية أو الخلايا الليفية اللحمية 2،10 ومفيدة للغاية لاختبار نجاعة الأدوية التي قد تحول دون غزو 5،6.
على الرغم من أن هذا البروتوكول يشير إلى استخدام الخلايا الليفية الأولية جلد الإنسان، فمن الممكن استخدام الخلايا الليفية الأولية من أنواع الأنسجة الأخرى، وفقا لنوع الأنسجة قيد التحقيق. ومن الممكن أيضا لإنشاء الثقافات باستخدام الخلايا الليفية خلد، بما في ذلك الخلايا التي تم ستابلي مع تقارن بروتين فلوري. وبهذه الطريقة يمكن أن توصف الخلايا اللحمية والأورام على حد سواء لتصور خلية خلية التفاعلات أثناء غزو 11.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | GIBCO, by Life Technologies | 21430 | - |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
| FCS | PAA Laboratories | A15-101 | - |
| 35 mm dishes | Falcon BD | 353001 | For step 3.4 |
| 60 mm dishes | Falcon BD | 353004 | For step 5.2 |
| Spring forceps blunt | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | E003/02 | Toothed, not smooth |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
| Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma-Aldrich | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
| Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 - 14 kD |
| PBS | Oxford Labware | BR0014G | - |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | - |
| 24 well dish | Falcon BD | 353047 | For step 4.1 |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | - |
References
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion. Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).
- Patsialou, A. Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor. Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).
- Serrels, A. Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development. Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).
- Timpson, P. Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53. Cancer Res. 71, 747-757 (2011).
- Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. 4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors. Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).
- Fusenig, N. E. Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).
- Nystrom, M. L. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205, 468-475 (2005).
- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).
- Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation. Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).
