קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Summary

שיטה מתוארת להכנת מטריצה ​​3-ממדית המורכבת מסוג קולגן אני ופיברובלסטים אנושיים ראשוניים. ג'ל organotypic זה משמש כמצע שימושי להעריך נדידת תאים פולשניים כי זה מחק את התכונות בסיסיות של הרקמה סטרומה והוא נוח לצורות רבות של מיקרוסקופיה.

Abstract

נדידת תאים היא בסיסית להיבטים רבים של ביולוגיה, כולל פיתוח, ריפוי פצעים, תגובות התאיות של המערכת החיסונית, וגרורות של תאים סרטניים. הגירה נחקרה בcoverslips זכוכית כדי להפוך את דינמיקה המתאימים לחקירה סלולרית על ידי מיקרוסקופ אור. עם זאת, זה הפך להיות ברור שהיבטים שונים של נדידת תאים תלויים בתכונות של הסביבה המקומית, כולל את האלסטיות שלו, הרכבו חלבון, והגודל נקבובי, שאינם מיוצגים בנאמנות על ידי שני מצעים נוקשים ממדים כגון זכוכית ופלסטיק ^1. יתר על כן, אינטראקציה עם סוגים אחרים של תאים, כולל fibroblasts סטרומה ² ו ³ תאים חיסוניים, הוכחה לשחק תפקיד קריטי בקידום הפלישה של תאים סרטניים. החקירה ברמה המולקולרית הראתה כי יותר ויותר דינמיקה מולקולרית, כולל תגובה לטיפול תרופתי, של תאים זהים שונה באופן משמעותי בהשוואה במבחנת in vivo ^4.

באופן אידיאלי, זה יהיה הכי טוב כדי ללמוד נדידת תאים בהקשר הטבעי שלה ביצורי חיים, אולם זה לא תמיד אפשרי. מערכות ביניים רקמות תרבות, כגון מטריקס תא נגזר, matrigel, תרבות organotypic (מתואר כאן) explants רקמות, organoids, וxenografts, לכן ביניים ניסיוניים חשובים. מערכות אלו היבטים מסוימים של מקורבים בסביבת vivo אלא הם נוחים יותר למניפולציה ניסויית כגון שימוש בקווים ביציבות transfected סלולריות, משטרי טיפול תרופתי, לטווח ארוך והדמיה ברזולוציה גבוהה. מערכות ביניים כאלה שימושיים במיוחד כהוכחת עילה לאימות בדיקות ולקבוע פרמטרים הנדרשים לתמונת התגובה הדינמית של תאים וכתבי ניאון לפני ביצוע הדמית in vivo ^5. ככאלה, הם יכולים לשמש תפקיד חשוב בהקטנת הצורך בניסויים בפרנסהבעלי חי ז.

Protocol

1. הקמת תרבויות פיברובלסטים מהעור explants

1. 4 ביופסיות אגרוף מ"מ שנרכשו מזרוע אנושית ממוקמות בממ תוספת 100 יחידות / המ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל, ו0.25 מיקרוגרם / המ"ל Fungizone.
2. לקצץ כל שומן תת עורי וקוצצים דקים את הביופסיה לחתיכות קטנות על ידי מתנדנד להב אזמל מספר 24 נגד התחתון של צלחת פטרי.
3. תרחיף רקמת מקום בבקבוק 25 סנטימטרים ² רקמת תרבות עם תקשורת צמיחת פיברובלסטים הראשונית (MEM בתוספת 10% FCS, 100 יחידות / המ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל, ו25 מיקרוגרם / המ"ל Fungizone) הוסיף עד פני השטח של בקבוק הוא מכוסה אך עומק נוזל אינו מספיק לרקמות לצוף.
4. לאחר 3 ימי דגירה על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO _2, להוסיף 3 מ"ל של תקשורת צמיחת פיברובלסטים הראשונית.
5. לאחר 3 ימי דגירת תקשורת שינוי נוסף בתקשורת צמיחה העיקרית פיברובלסטים טריות, או אם cells כמעט confluent הם עשויים להיות מפוצלים 01:04 לתקשורת טריה. (Fungizone ניתן להשמיט מנקודה זו ואילך).

2. שלב I - הכנת קולגן אני מזנבות עכברים

הערה: פרוטוקול כ 12-14 זנבות עכברי מתבגר (טריים או קפואים)

1. הכן את זנב חולדה על ידי השטיפה באתנול 70% ולהסיר גידים כדלקמן:
2. הסרת עור מזנב חולדה על ידי חיתוך באמצע הזנב מלמעלה עד למטה עם אזמל ומתגלגל לאורכו של הזנב.
3. ניתוק גיד מהליבה של האזור הפרוקסימלי של הזנב.
4. הסר גיד לעבר האזור הדיסטלי של זנב הימנעות הנדן באמצעות מלקחי שיניים.
5. חלץ 1 גרם של גיד / 250 מ"ל של חומצה אצטית 0.5 מ 'על ידי ערבוב ב4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
6. צנטריפוגה תמצית (7500 XG) במשך 30 דקות וזורקים את הכדור.
7. הוסף נפח שווה של 10% (w / v) NaCl לsupernatant, ומערבב 30-60 דקות.
8. דיאליזת פתרון קולגן נגד 6-8 שינויים של 6L ~ החומצה אצטית mM 17.5 (חומצה אצטית קרחונית 1 מ"ל לליטר מים קרים, 2 x שינוי היומי).
9. צנטריפוגה קולגן dialysed ב 30,000 XG עבור 1.5 שעות.
10. הסרת supernatant ומקום בבקבוק סטרילי.
11. התאם קולגן אני ריכוז ל~ 2 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות חומצה אצטית 0.5 מ"מ ב 4 ° C.

3. שלב השני - הגדרת מטריצת 3D עם fibroblasts המוטבע (לאפשר לחוזה במשך 8 ימים).

1. הרכב את תמהיל שימוש בריאגנטים קרים ב 4 ° C בבקבוק מראש מצונן. שמור לי קולגן על קרח.
2. לT75 בקבוק אחד של fibroblasts העיקרי confluent (~ מספר תא 1 x 10 ⁶⁾ שימוש:
   • קולגן 25 מ"ל עכברוש זנב (כ conc 2mg/ml)
   • 3 מיליליטר 10xממ
   • 0.22 M NaOH: הראשון, להוסיף 2ml, אז תוך ערבוב טיפה חכמה, עד הקולגן הופך כתום,
   • אבל לא ורוד (בדרך כלל עד 3 מ"ל). משוער p ^H = 7.2.
   • הערה: חשוב לוודא שבינוני / ג'ל נשאר ניטראלי או מעט חומצי כfibroblasts לא יתכווץ ג'ל אם ייחשף לתנאי אלקליין אפילו מעט.
3. Trypsinise את fibroblasts, לסובב ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר supernatant.
4. במהלך 5 דקות ספין לעיל: היכון 12 x 35 מ"מ מנות פלסטיק - בדרך כלל להשיג 12 מנות מבקבוק אחד של fibroblasts / שילוב הקולגן.
5. Re-להשעות fibroblasts ב3 FCS מ"ל ולהוסיף מייד לתערובת והמערבבים קולגן.
6. צלחת כ -2.5 מ"ל של קולגן / פיברובלסטים למנה במהירות אפשרית. נסו להימנע מבועות והגדרת קולגן.
7. בואו קולגן נקבע על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של CO ₂ 5% באוויר במשך 10 דקות.
8. הוסף 1ml של פיברובלסטים לגדולה התקשורת (DMEM + 10% FCS).
9. לנתק את מטריצת הקולגן / פיברובלסטים מהצדדים של הצלחת באמצעות פיפטה.
10. היום הבא: הוסף 1ml של תקשורת צמיחת פיברובלסטים (DMEM + 10% FCS).
11. שינוי תקשורת בכל יום אחר. אפשר מטריצת הקולגן / פיברובלסטים לחוזה לכ 8 ימים, עד שהם מתאימים בצלחת 24 היטב (התכווצות מ ~ 3.5 סנטימטרים עד 1.5 סנטימטרי קוטרו, ראה תרשים 1).

הערה: ריכוז קולגן צריך להיות מותאם כך שיתאים ליישום. תדלל יותר את פתרון קולגן, מהר יותר זה יהיה חוזה על ידי fibroblasts. הבדלים קלים בקצב התכווצות יהיו מנוסים עם קבוצות שונות של קולגן באותו הריכוז. בדומה לכך, תרבויות שונות פיברובלסטים תתכווצנה בג'לי קולגן בשיעורים שונים, וככל שיותר fibroblasts להציג, מהר יותר את קצב ההתכווצות. ריכוז קולגן וצפיפות פיברובלסטים ולכן יכולים להתאים לשינוי בשיעור של התכווצות,והצפיפות הסופית של ג'ל קולגן.

4. השלב II - תאי ציפוי של עניין על גבי המטריצה

שימו לב: לעקר כל המלקחיים וציוד עם אתנול לפני השימוש.

1. שימוש במלקחיים קהים, בעדינות להעביר מטריצת חוזה לצלחת 24 היטב. ודא זה לא קיפול.
2. הכן את ההשעיה של תאים של ריבית בכ 4 10 1ml x ⁴ / מ"ל וצלחת (לאחר תאי trypsinising, ספין להיפטר טריפסין) על גבי המטריצה. מספר אמיתי של תאים הדרושים משתנה בהתאם לסוג התא בשימוש. מדיום סלולרי צריך להיות מדיום גידול נורמלי לתאים של עניין.
3. לאפשר לתאים לגדול למפגש על גבי המטריצה, כ 3-5 ימים.

5. השלב III - העברת המטריצה ​​לרשת לפלישה (כ 0-21 ימים)

1. חותך רשתות נירוסטה ליצור חצובה והחיטוי לפני השימוש (ראה איור 2).
2. הנח רשת הסטרילי במנת הסנטימטר 6, להוסיף תקשורת צמיחה לרמה שמעל לרשת (כ 10.5ml). מטריצה ​​מניח על הרשת ועדינות לשאוב תקשורת כדי התחתון של המטריצה ​​הוא במגע עם תקשורת, אבל לא שקוע. זה נקרא כממשק אוויר / נוזל, שיוצר שיפוע שמקדם פלישה. החלף בינוניים כל ימים (ראה איור 2).
3. לחיות תא, הדמית קשר באמצעות תאי ניאון ניתן הדמיה בשלב זה או קודם לכן. קולגן המכווץ או סיבי אני יכול להיות צלמתי באמצעות דור הרמוני שני (SHG, ראה איור 3). באמצעות עירור רב פוטונים משולבים עם גילוי שדה רחב אנו מוצאים שSHG יכול להיות צלם לפחות 100 מיקרומטר לתוך המטריצה, ואילו תאים להביע GFP cytoplasmic יכולים להיות צלם לפחות 200 מיקרומטר עמוק.

הערה: עם כל כבוד לכימות של פלישה, היום שבו matricies מונח על הרשתות מגדיר יום 0. מיקום ברשתות יוצר שיפוע של תקשורת סלולרית התרבות שמקדם int פלישה o המטריצה. דוגמאות ניתן הדמיה מעל 1 הבא - 21 יום (או יותר) כדי להעריך את תהליכים ביולוגיים כגון פלישה, התפשטות, הישרדות או בידול (ראה רשימת הפניה).

6. השלב IV - קיבוע

1. הוסף 5 מ"ל של 4% PFA בצינור פלקון.
2. העברת המטריצה ​​על גבי משטח שטוח. חותך את המטריצה ​​במחצית עם אזמל טרי ונקי (כפי שאתה תהיה מכתים את החתך), הרם את המטריצה ​​עם אזמל והעברה ל4% PFA, לתקן במשך הלילה.
3. מטריצות Organotypic עכשיו מוכנות להכתים עם נוגדן / כתם של בחירה (ראה איור 3).

7. תוצאות נציג:

איור דוגמה 1 של תערובת פיברובלסטים קולגן-החוזה הראשון של פיברובלסטים וקולגן זנב חולדה מנותקת מצלחת הפטר ואפשר לחוזה על 6-8 ימים.

איור 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/>
תרשים התקדמות assay 2 Organotypic. , סכמטי של קבוצת organotypic והתקדמות. ב ', דוגמה למטריצת הקולגן / פיברובלסט על גבי נירוסטה, רשת סטרילי כדי ליצור אוויר / ממשק נוזלי.

איור 3 יישומים של assay organotypic. A, B לבלב אדנוקרצינומה תאי ductal אינם פולשניות וחודרניים (PDAC) פולשים לאורך זמן עם מטריצת organotypic. C, חיים מקבילים עור מראה האפידרמיס מרובדת על מרכיב עור collagenous פיברובלסטים-הוסכם. ד, C8161 תאים מלנומה בפולש לפיברובלסטים -נדבק מקביל collagenous העור. דואר, תאים פולשניים PDAC (ירוק) ואינטראקציה עם פלישת fibroblasts (אדום) בתוך מטריצת organotypic. F

Discussion

כאן אנו מציגים שיטה לייצור של מטריצה ​​מתאימה ללימודים של נדידת תאים פולשניים ^{06-08 מרס} ממדים. המטריצה ​​מורכבת מסוג 1 סיבים קולגן, שנדבקו על פני תקופה של מספר ימים על ידי fibroblasts אפידרמיס האנושי ראשוני. קולגן הוא הוכן על ידי מיצוי חומצה, לא עיכול אנזימטי, השומר תגובתיות בקצות פולי פפטיד ומקדם קישור צולב של סיבי הקולגן למצרפים גדולים יותר על נטרול של תנאי חיץ ^9. התוצאה היא ג'ל מחדש היווה אשר מחק באופן הדוק יותר את התכונות של קולגן בגוף חי ויש לו השלכות רבות על המאפיינים החודרניים של תאים בתרבית בג'לי. זה לא משנה אם חומר טרי או קפוא החל משמש, אבל שימוש בזנבות עכברים מתבגרים חשוב כי קולגן צלב-linking הוא יותר רופף בבעלי חיים צעירים. קולגן מבעלי חיים צעירים לכן קל יותר לחלץ, ומחדש מהווים-wנאמנות גבוהה ith.

מטריצת הקולגן יכולה להיות קבועה ומוכתמת נוגדנים מכוונים נגד גם בתאים סרטניים פולשניים או פיברובלסטים סטרומה ^2,10 ושימושיים מאוד לבדיקת היעילות של תרופות שעלולות לעכב פלישת ^5,6.

למרות שפרוטוקול זה מצביע על השימוש בfibroblasts עור האנושי הראשוני, זה אפשרי להשתמש פיברובלסטים ראשוניים מסוגי רקמות אחרים, בהתאם לסוג של רקמה תחת חקירה. אפשר גם להקים תרבויות באמצעות fibroblasts הנציח, כולל תאים שכבר transfected ביציבות עם conjugates החלבון פלואורסצנטי. בדרך זו גם תאי סטרומה וגידול יכולים להיות מתויג לדמיין אינטראקציות תא סלולרי במהלך הפלישה ^11.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x MEM	GIBCO, by Life Technologies	21430	-
NaOH	Sigma-Aldrich	367176-500G	Prepare 0.22 M stock in water
FCS	PAA Laboratories	A15-101	-
35 mm dishes	Falcon BD	353001	For step 3.4
60 mm dishes	Falcon BD	353004	For step 5.2
Spring forceps blunt	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	E003/02	Toothed, not smooth
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 4% in PBS prior to use
Screens for cd-1, size 40 mesh	Sigma-Aldrich	S07707-5EA	Stainless steel grids, 5 per pack
Dialysis tubing	Medicell International	7607 2295	12 - 14 kD
PBS	Oxford Labware	BR0014G	-
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	242853	-
24 well dish	Falcon BD	353047	For step 4.1
Fungizone	Invitrogen	15290018	-