Summary
Описан способ получения 3-мерной матрицы, состоящей из коллагена типа I и первичных фибробластов человека. Это органотипических гель служит полезным субстратом для оценки инвазивных миграции клеток, поскольку он имитирует основные характеристики ткани стромы и поддаются многие формы микроскопии.
Abstract
Миграция клеток лежит в основе многих аспектов биологии, в том числе развития, заживления ран, клеточные реакции иммунной системы, и метастазирование опухолевых клеток. Миграция была изучена на стекло покровные для того, чтобы сделать сотовую динамики поддаются расследованию помощью световой микроскопии. Тем не менее, стало ясно, что многие аспекты миграции клеток зависят от особенностей местной окружающей среды, включая ее эластичность, белковый состав и размер поры, которые не добросовестно представлены жесткие двумерных поверхностей, таких как стекло и пластик 1. Кроме того, взаимодействие с другими типами клеток, включая стромальные фибробласты 2 и иммунных клетках 3, было показано, играют важную роль в содействии вторжение раковых клеток. Исследования на молекулярном уровне все чаще показали, что молекулярная динамика, в том числе ответ на медикаментозное лечение, одинаковых клеток значительно отличается по сравнению
В идеале, было бы лучше изучать миграцию клеток в ее естественным контекстом, в живых организмах, однако это не всегда возможно. Промежуточные культуры тканей систем, таких как клетки, полученные матрицей, матригель, органотипических культуры (описано здесь) ткани эксплантов, органоиды, и ксенотрансплантатов, поэтому важные экспериментальные промежуточных продуктов. Эти системы приближенных некоторые аспекты в естественных условиях окружающей среды, но являются более пригодными для экспериментальной манипуляции, такие как использование стабильно трансфицированных клеточных линий, режимы лечения наркозависимости, долгосрочные и изображений с высоким разрешением. Такие промежуточные системы особенно полезны в качестве полигона для проверки датчиков и установить параметры, необходимые для изображения динамических характеристик клеток и флуоресцентных журналистам до проведения визуализации в естественных условиях 5. Как таковые, они могут играть важную роль в снижении потребности в экспериментах по живуг животных.
Protocol
1. Создание культуры фибробластов из кожи эксплантов
- 4 мм биопсии удар, приобретенные у человека предплечья находятся в MEM дополнен 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл Fungizone.
- Обрезать любой подкожного жира и мелко нарезать биопсию на мелкие кусочки по качалки № 24 лезвие скальпеля на дно чашки Петри.
- Место ткани пульпы в 25 см 2 культуре ткани колбу с первичными роста фибробластов средств массовой информации (MEM с добавлением 10% FCS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 25 мкг / мл Fungizone) добавляют до поверхности колбы покрыты жидкостью, но глубина недостаточна для ткани плавать.
- После 3 дней инкубации при 37 ° C во влажной атмосфере 5% CO 2, добавьте 3 мл основной среды роста фибробластов.
- После еще 3 дня среды инкубации изменений со свежим первичным медиа роста фибробластов, или если челLs почти сливающийся они могут быть разделены 1:04 в свежей среде. (Fungizone может быть опущена с этого момента).
2. I этап - подготовка коллагена I от крысиные хвосты
Примечание: Протокол примерно 12-14 подростков (свежей или замороженной) хвосты крыс
- Подготовка крысы хвост мытья в 70% этанола и удалить сухожилия следующим образом:
- Удалите кожу от хвоста крысы, нарезая в середине хвоста сверху вниз с помощью скальпеля и звон по всей длине хвоста.
- Отсоедините сухожилия от ядра проксимальной области хвоста.
- Удалить сухожилия к дистальной части хвоста избежать оболочка использованием зубчатых щипцов.
- Извлечение 1 г сухожилия / 250 мл 0,5 М уксусной кислоты при перемешивании при температуре 4 ° C в течение 48 часов.
- Центрифуга экстракт (7500 мкг) в течение 30 минут и удалить осадок.
- Добавить равный объем 10% (вес / объем) NaCl в супернатант, и перемешивают в течение 30-60 мин.
- Диализировать коллагена решение против 6-8 изменениях 6L ~ 17,5 мм уксусной кислоты (1 мл ледяной уксусной кислоты на литр холодной воды, изменением 2 раза в день).
- Центрифуга диализу коллагена при 30000 х г в течение 1,5 часов.
- Удалите супернатант и место в стерильной колбе.
- Отрегулируйте коллагена I концентрации ~ 2 мг / мл с помощью 0,5 мМ уксусной кислоты при температуре 4 ° C.
3. II этап - создание 3D-матрицы со встроенными фибробластов (позволяют заключить контракт в течение 8 дней).
- Соберите смеси с использованием холодного реагенты при температуре 4 ° C в предварительно охлажденную бутылку. Держите коллагена I на льду.
- С одной колбе T75 вырожденных первичных фибробластов (~ количество клеток 1 х 10 6) использование:
- 25 мл крысиного хвоста коллагена (около конц 2mg/ml)
- 3 мл 10xMEM
- 0,22 М NaOH: во-первых, добавить 2 мл, затем по каплям при перемешивании, пока коллагена становится оранжевым,
- но не розовый (как правило, до 3 мл). Приблизительное р H = 7,2.
- Примечание: Важно, чтобы убедиться, что средняя / гель остается нейтральной или слабокислой как фибробласты не будут сокращаться гель при воздействии даже слегка щелочной среде.
- Trypsinise фибробластов, спина при 400 мкг в течение 5 минут и удалить супернатант.
- В течение 5 минут крутить выше: Подготовка 12 х 35 мм пластиковая посуда - как правило, достижения 12 блюд из одной колбы фибробластов / коллаген смеси.
- Повторное приостановить фибробластов в 3 мл ФТС и сразу же добавить к смеси коллагена и перемешать.
- Плита примерно 2,5 мл коллагена / фибробластов за блюдо как можно быстрее. Постарайтесь, чтобы избежать пузырей и коллагена настройки.
- Пусть коллагена установлен на уровне 37 ° C во влажной атмосфере 5% CO 2 в воздухе в течение 10 мин.
- Добавить 1 мл фибробластов растий среды (DMEM + 10% FCS).
- Снимите коллаген / фибробластов матрицу из сторон блюдо с помощью пипетки.
- Следующий день: Добавить 1 мл роста фибробластов среды (DMEM + 10% FCS).
- Изменение средств массовой информации каждый день. Разрешить коллаген / фибробластов матрицы контракт на приблизительно 8 дней, пока они не вписываются в 24-луночных блюдо (сокращение от ~ 3,5 см до 1,5 см в диаметре, см. Рисунок 1).
Примечание: коллагеновые концентрация должна быть скорректирована в соответствии с приложением. Чем больше разбавить раствора коллагена, тем быстрее он будет заключен контракт на фибробласты. Незначительные различия в сокращении ставка будет опыт работы с различными партиями коллагена в той же концентрации. Кроме того, разные культуры фибробластов сократится коллагена гелей с различной скоростью, и чем больше фибробластов представить, тем быстрее скорость сокращения. Концентрация коллагена и фибробластов плотности, следовательно, с корректировкой на изменение скорости сокращения,и окончательная плотность коллагеновый гель.
4. II этап - покрытие клеток интерес в верхней части матрицы
Примечание: Стерилизовать всех щипцов и оборудования с этанолом перед использованием.
- Использование тупым пинцетом, осторожно двигаться по контракту матрица 24-а блюдо. Убедитесь, что она не раз.
- Подготовка суспензии клеток интерес примерно 4 х 10 4 / мл и 1 мл пластины (после trypsinising, спина клетки, чтобы избавиться от трипсина) в верхней части матрицы. Фактическое количество клеток необходимо будет варьироваться в зависимости от типа клеток используются. Сотовые среде должна быть нормальной среде роста для клеток интерес.
- Разрешить клетки расти до слияния в верхней части матрицы, примерно 3-5 дней.
5. III этап - передача матрицы к сетке для вторжения (примерно 0-21 дней)
- Вырезать нержавеющими решетками для создания штатив и стерилизации перед использованием (см. Рисунок 2).
- Поместить стерильную сетку6 см блюдо, добавить питательной среды выше уровня сетки (примерно 10.5ml). Место матрицы на сетку и осторожно аспирации СМИ, чтобы в нижней части матрицы находится в контакте со средствами массовой информации, но не под водой. Это называется, как воздух / жидкость, которая создает градиент, что способствует вторжению. Заменить среднего каждые два дня (см. Рисунок 2).
- Живая клетка, контекстной визуализации с использованием флуоресцентных клеток может быть отображена на данном этапе или ранее. По контракту или фибриллярных коллагеновых я может быть отображена использованием генерации второй гармоники (SHG, см. рисунок 3). Использование многофотонного возбуждения в сочетании с широким полем обнаружения мы находим, что SHG может быть отображена не менее 100 мкм в матрицу, в то время как клетки, экспрессирующие GFP цитоплазматических может быть отображена по крайней мере, 200 мкм глубоко.
Примечание: В отношении количественного вторжения, в день, на который матрицами размещены на сетках определяет День 0. Размещение на сетках создается градиент СМИ культуре клеток, что способствует вторжению Int Ø матрицы. Образцы могут быть отображены в течение ближайших 1 - 21 дней (или больше) для оценки биологических процессов, таких как вторжение, пролиферации, выживания или дифференциации (см. список литературы).
6. IV этап - фиксация
- Добавьте 5 мл 4% PFA в трубке Falcon.
- Передача матрицы на плоской поверхности. Разрежьте пополам матрицы со свежим чистым скальпелем (как вы будете окрашивания сечение), поднимите матрица с скальпеля и передачи до 4% PFA, исправить в течение ночи.
- Органотипической матриц готовы для окрашивания с антителами / пятно выбор (см. рисунок 3).
7. Представитель результаты:
Рисунок 1 Пример фибробластов по контракту коллагена I. Смесь из фибробластов и крысы хвост коллагена отделяется от чашки Петри и позволили заключить контракт в течение 6-8 дней.
Рисунок 2 "SRC =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/>
Рисунок 2 органотипической прогрессии анализа. , Схема органотипических настройки и прогрессии. B, пример коллаген / фибробластов матрицы на верхнем из нержавеющей стали, стерильные сетки для создания воздух / жидкость.
Рисунок 3 Применение органотипических анализа. A, B неинвазивные и инвазивные аденокарциномы поджелудочной железы протоков (ККПР) клеток вторжения со временем органотипических матрицы. C, живущих кожи эквивалентной показывает стратифицированную эпидермиса на фибробласты по контракту коллагеновых кожного компонента. D, C8161 клеток меланомы вторжения в систему, чтобы фибробластов -контракт коллагеновых дермального эквивалента. Е, инвазивные PDAC клеток (зеленый) взаимодействует и вторжение с фибробластами (красный) в органотипических матрицы. F
Discussion
Здесь мы представляем метод для производства 3-мерных матриц подходит для изучения инвазивных миграции клеток 6-8. Матрица состоит из коллагена 1 типа волокон, которые работают по контракту в течение нескольких дней первичного человеческого эпидермиса, фибробласты. Коллаген получают путем извлечения кислот, не ферментативного расщепления, который сохраняет реактивность в полипептидных целей и способствует сшивки коллагена в более крупные агрегаты по нейтрализации буфера условиях 9. Это приводит к повторной официальных гель, который более точно имитирует особенности коллагена в естественных условиях и имеет важные последствия для инвазивных свойств клеток, культивируемых в гелях. Это не имеет значения, свежие или замороженные исходного материала используется, но использование подростков хвосты крыс важно, потому что коллаген сшивания более лабильной у молодых животных. Коллаген я от молодых животных, следовательно, легче извлекать и повторно представляет Wго более высокого качества.
Коллагеновой матрицы может быть фиксировали и окрашивали антителами, направленными против любой инвазивной опухоли клеток стромальных фибробластов или 2,10 и очень полезно для тестирования эффективности лекарственных средств, которые могли бы препятствовать вторжению 5,6.
Хотя этот протокол предполагает использование первичных человеческих фибробластов кожи, целесообразно использовать первичные фибробласты от других типов тканей, в зависимости от типа ткани под следствием. Кроме того, можно установить культур с использованием увековечили фибробластов, в том числе клеток, которые были стабильно трансфицировали с люминесцентными конъюгатов белка. Таким образом, и стромальные и опухолевых клеток могут быть помечены для визуализации межклеточных взаимодействий во время вторжения 11.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | GIBCO, by Life Technologies | 21430 | - |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
| FCS | PAA Laboratories | A15-101 | - |
| 35 mm dishes | Falcon BD | 353001 | For step 3.4 |
| 60 mm dishes | Falcon BD | 353004 | For step 5.2 |
| Spring forceps blunt | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | E003/02 | Toothed, not smooth |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
| Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma-Aldrich | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
| Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 - 14 kD |
| PBS | Oxford Labware | BR0014G | - |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | - |
| 24 well dish | Falcon BD | 353047 | For step 4.1 |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | - |
References
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion. Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).
- Patsialou, A. Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor. Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).
- Serrels, A. Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development. Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).
- Timpson, P. Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53. Cancer Res. 71, 747-757 (2011).
- Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. 4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors. Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).
- Fusenig, N. E. Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).
- Nystrom, M. L. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205, 468-475 (2005).
- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).
- Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation. Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).
