Organotypisk Kollagen I Analys: en formbar plattform att bedöma Cell Beteende i en 3-dimensionell sammanhang

Summary

Ett förfarande beskrivs för framställning av en 3-dimensionell matris bestående av kollagen typ I och primära humana fibroblaster. Denna organotypisk gel fungerar som en användbar substrat för att bedöma invasiv cellmigration eftersom det härmar grundläggande funktionerna i vävnad stroma och är mottaglig för många former av mikroskopi.

Abstract

Cellmigration är grundläggande för många aspekter av biologin, inklusive utveckling, sårläkning, de cellulära svaren i immunsystemet, och metastas av tumörceller. Migration har studerats på täckglas för att göra cellulära dynamik mottagliga för utredning av ljusmikroskop. Emellertid har det blivit klart att många aspekter av cellmigration beror på egenskaperna hos den lokala miljön inklusive dess elasticitet, proteinkomposition, och porstorlek, som inte troget representeras av styva tvådimensionella substrat, såsom glas och plast ^1. Vidare, har växelverkan med andra celltyper, inklusive stromala fibroblaster ² och immunceller ^3, visats spela en kritisk roll för att främja invasionen av cancerceller. Utredning på molekylär nivå har alltmer visat att molekyldynamik, inklusive svar på läkemedelsbehandling, av identiska celler signifikant jämfört In vitro och in vivo ^4.

Idealt skulle det vara bäst att studera cellmigration i sitt naturligt förekommande sammanhang i levande organismer, men detta är inte alltid möjligt. Mellanliggande vävnadsodlingsplattor system, såsom cellhärlett matris, Matrigel, organotypisk kultur (beskrivs här) explantat vävnad, organoids och xenografter, är därför viktiga experimentella mellanprodukter. Dessa system ungefärliga vissa aspekter av en in vivo miljö men är mer mottagliga för experimentell manipulering såsom användning av stabilt transfekterade cellinjer, läkemedel regimer behandling, långsiktiga och hög upplösning. Sådana mellanliggande system är särskilt användbara som bevis skäl att validera sonder och etablera parametrar som krävs för att bilden dynamiska svaret av celler och fluorescerande reportrar innan företaget avbildning in vivo ^5. Som sådana, kan de tjäna en viktig roll för att minska behovet av experiment på living djur.

Protocol

1. Etablering av fibroblastkulturer från huden explantat

1. 4 mm stansbiopsier förvärvats från human underarm placeras i MEM kompletterat 100 enheter / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 0,25 pg / ml Fungizone.
2. Trimma alla subkutana fettet och finhacka biopsin i små bitar genom att gunga ett nummer 24 skalpellblad mot botten av petriskålen.
3. Placera vävnad uppslamning i en 25 cm ² vävnadsodlingskolv med primära medier fibroblasttillväxtfaktorer (MEM kompletterat med 10% FCS, 100 enheter / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 25 ug / ml Fungizone) tillsattes tills ytan av kolven är täckt men flytande djup är otillräcklig för vävnad att flyta.
4. Efter 3 dagars inkubation vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO _2, tillsätt 3 ml primära medium fibroblasttillväxtfaktorer.
5. Efter ytterligare 3 dagar medier inkubation förändring med färska primära medium fibroblasttillväxtfaktorer, eller om celÄr nästan sammanflytande de kan delas 01:04 i nya medier. (Fungizone kan utelämnas från denna punkt och framåt).

2. Steg I - Beredning av kollagen I från skolästfiskar

Obs: Protokoll för cirka 12-14 ungdomar (färska eller frysta) skolästfiskar

1. Förbered råttsvans genom tvättning i 70% etanol och avlägsna senor enligt följande:
2. Avlägsna huden från råttsvans genom skärning i mitten av svansen från topp till botten med en skalpell och pealing längs svansen.
3. Loss sena från kärnan av den proximala regionen av svansen.
4. Avlägsna sena mot den distala regionen av svansen undvika höljet med tandade tång.
5. Extrakt 1 g senor / 250 ml 0,5 M ättiksyra genom omröring vid 4 ° C under 48 timmar.
6. Centrifugera extraktet (7.500 x g) under 30 minuter och kassera pelleten.
7. Tillsätt en motsvarande volym av 10% (vikt / volym) NaCl till supernatanten, och omrör under 30-60 min.
8. Dialysera kollagenlösningen mot 6-8 byten av 6L ~ 17,5 mM ättiksyra (1 ml isättika per liter kallt vatten, förändring 2 x dagligen).
9. Centrifugera dialyseras kollagen vid 30.000 xg under 1,5 timmar.
10. Avlägsna supernatanten och placera i steril kolv.
11. Justera kollagen I koncentrationen till ~ 2 mg / ml med användning av 0,5 mM ättiksyra vid 4 ° C.

3. Steg II - Ställa in 3D-matris med inbäddade fibroblaster (möjligt att ingå avtal om 8 dagar).

1. Montera blandningen med kall reagens vid 4 ° C i en pre-kyld flaska. Håll kollagen I på is.
2. För en T75 kolv av konfluenta primära fibroblaster (~ cell nummer 1 x 10 ⁶⁾ Användning:
   • 25 ml råttsvanskollagen (ca konc 2mg/ml)
   • 3 ml 10xMINNE
   • 0,22 M NaOH: först, tillsätt 2 ml, sedan droppvis under omröring, tills kollagenet blir orange,
   • men inte rosa (oftast upp till 3 ml). Ungefärlig p ^H = 7,2.
   • Obs: Det är viktigt att säkerställa att mediet / gelén förblir neutralt eller svagt surt eftersom fibroblaster inte kommer att krympa gelén om de utsätts för även lätt alkaliska betingelser.
3. Trypsinise fibroblasterna, snurra vid 400 xg under 5 minuter och avlägsna supernatanten.
4. Under 5 min snurra ovan: Förbered 12 x 35 rätter mm plast - normalt uppnår 12 rätter från en flaska av fibroblaster / kollagen mix.
5. Återsuspendera fibroblaster i 3 ml FCS och omedelbart lägga till kollagen mixen och rör om.
6. Platta ca 2,5 ml av kollagen / fibroblast-per skål så snabbt som möjligt. Försök att undvika bubblor och kollagen inställning.
7. Låt kollagen inställd vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO ₂ i luft under 10 minuter.
8. Lägg 1 ml av fibroblast växere medium (DMEM + 10% FCS).
9. Lossa kollagen / fibroblast-matris från sidorna av skålen med hjälp av en pipett.
10. Nästa dag: Lägg 1 ml av media fibroblasttillväxtfaktorer (DMEM + 10% FCS).
11. Ändra media varannan dag. Tillåt kollagen / fibroblast matris kontrakt för cirka 8 dagar, tills de passar in i en 24-väl maträtt (kontraktion från ~ 3,5 cm till 1,5 cm i diameter, se figur 1).

Anmärkning: kollagen koncentrationen bör justeras för att passa tillämpningen. Ju mer späda kollagenlösningen, desto snabbare kommer det att läggas ut på entreprenad av fibroblaster. Små skillnader i kontraktion kurs kommer att upplevas med olika satser av kollagen i samma koncentration. På samma sätt kommer olika fibroblastkulturer ihop kollagen geler i olika takt, och ju fler fibroblaster närvarande, desto snabbare av kontraktion. Kollagen koncentration och fibroblast densitet kan därför med justerat för att modifiera graden av kontraktion,och den slutliga densiteten för kollagengel.

4. Steg II - Plating celler av intresse ovanpå matrisen

Obs: Sterilisera alla pincett och utrustning med etanol före användning.

1. Med hjälp av trubbiga pincett försiktigt flytta kontrakterade matris till 24-väl maträtt. Se till att det inte lägga sig.
2. Bered suspension av celler av intresse vid ungefär 4 x 10 ⁴ / ml och plattan 1ml (efter trypsinising, snurra celler att bli av trypsin) ovanpå matrisen. Faktiskt antal som behövs celler varierar beroende på cell som används typ. Cellmedium bör normalt tillväxtmedium för cellerna av intresse.
3. Tillåt celler växa till konfluens på toppen av matrisen, cirka 3-5 dagar.

5. Steg III - Överföra matrisen till ett galler för invasion (ungefär 0-21 dagar)

1. Skär av rostfritt stål galler för att skapa ett stativ och autoklav före användning (se figur 2).
2. Placera steril nätet i6 cm skål, tillsätt odlingsmedia till en nivå ovanför gallret (ca 10,5 ml). Placera matris på gallret och försiktigt aspirera media så botten av matrisen är i kontakt med media men inte nedsänkt. Detta kallas luft / vätske gränsytan, vilket skapar en gradient som främjar invasionen. Byt medium var två dagar (se figur 2).
3. Levande cell kan kontextuella avbildning med fluorescerande celler avbildas i detta skede eller tidigare. Den kontrakterade eller fibrillära kollagen I kan avbildas med hjälp andra harmoniska generationen (SHG, se figur 3). Att använda multi-foton-excitation kombinerad med brett fält detektering finner vi att SHG kan avbildas minst 100 um i matrisen, medan celler som uttrycker GFP cytoplasmisk kan avbildas minst 200 um djup.

Obs: När det gäller kvantifiering av invasion, definierar den dag då matricies placeras på gallren Dag 0. Placering på galler genererar en gradient av cellodlingsmedia som främjar invasion int o matrisen. Prover kan avbildas under nästa 1 till 21 dagar (eller längre) för att bedöma biologiska processer såsom invasion, proliferation, överlevnad eller differentiering (se referenslista).

6. Steg IV - Fixering

1. Tillsätt 5 ml av 4% PFA i en Falcon-rör.
2. Överför matrisen på en plan yta. Skär matrisen i halv med en ny ren skalpell (som du kommer att fläcka tvärsnittet), lyft matrisen med skalpell och överföring till 4% PFA, fixa över natten.
3. Organotypiska matriser är nu redo att färga med antikropp / fläck val (se figur 3).

7. Representativa resultat:

Figur 1 Exempel på fibroblastliknande kontrakterade kollagen I. Blandning av fibroblast och råttsvanskollagen loss från petriskålen och får ihop över 6-8 dagar.

Figur 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/>
Figur 2 organotypisk analys progression. A schematiskt organotypisk inrättats och progression. B, Exempel på kollagen / fibroblast-matris ovanpå rostfritt stål, steril rutnät för att skapa luft / vätske-gränsytan.

Figur 3 Tillämpningar av organotypisk analys. A, B icke-invasiva och invasiva pankreas duktal adenokarcinom (PDAC) celler invaderar över tiden med organotypisk matris. C levande hudekvivalent visar en skiktad epidermis på en fibroblast-kontrakterad kollagen dermal komponent. D invaderande C8161 melanomceller in i en fibroblast -kontrakterade kollagen dermal ekvivalent. E invasiva PDAC celler (grön) interagerar och invadera med fibroblaster (röd) inom organotypisk matrisen. F

Discussion

Här presenterar vi en metod för framställning av en 3-dimensionell matris lämplig för studier av invasiv cellmigration ^6-8. Matrisen består av 1 kollagen typ fibriller, som lagts över en period av flera dagar genom primära humana epidermala fibroblaster. Kollagenet framställs genom syraextraktion, inte enzymatisk digerering, vilket bevarar reaktivitet vid poly-peptid ändar och främjar tvärbindning av kollagenfibriller till större aggregat vid neutralisering av buffertbetingelser ^9. Detta resulterar i en rekonstituerad gel som mer nära efterliknar egenskaperna hos kollagen in vivo och har viktiga konsekvenser för de invasiva egenskaperna hos celler odlade i gelerna. Det spelar ingen roll om färska eller frysta utgångsmaterial används, men användningen av unga skolästfiskar är viktigt eftersom kollagen tvärbindning är mer labilt i yngre djur. Kollagen I från yngre djur är därför lättare att extrahera och åter utgör wed högre trohet.

Kollagenmatrisen kan fixeras och färgas med antikroppar riktade mot antingen invasiva tumörceller eller stromaceller fibroblaster ^2,10 och är mycket användbar för att testa effektiviteten av läkemedel som kan inhibera invasion ^5,6.

Även detta protokoll föreslår användningen av primära humana hudfibroblaster, är det möjligt att använda primära fibroblaster från andra vävnadstyper, beroende på vilken typ av vävnad som undersöks. Det är också möjligt att fastställa kulturerna med odödliggjorda fibroblaster, inklusive celler som har transfekterats stabilt med fluorescerande proteinkonjugat. På detta sätt både stromala och tumörceller kan märkas att visualisera cell-cell-interaktioner under invasion ^11.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x MEM	GIBCO, by Life Technologies	21430	-
NaOH	Sigma-Aldrich	367176-500G	Prepare 0.22 M stock in water
FCS	PAA Laboratories	A15-101	-
35 mm dishes	Falcon BD	353001	For step 3.4
60 mm dishes	Falcon BD	353004	For step 5.2
Spring forceps blunt	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	E003/02	Toothed, not smooth
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 4% in PBS prior to use
Screens for cd-1, size 40 mesh	Sigma-Aldrich	S07707-5EA	Stainless steel grids, 5 per pack
Dialysis tubing	Medicell International	7607 2295	12 - 14 kD
PBS	Oxford Labware	BR0014G	-
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	242853	-
24 well dish	Falcon BD	353047	For step 4.1
Fungizone	Invitrogen	15290018	-