Summary
एक 3 - आयामी मैट्रिक्स कोलेजन प्रकार मैं और प्राथमिक मानव fibroblasts से मिलकर की तैयारी के लिए एक विधि वर्णित है. इस organotypic जेल इनवेसिव सेल प्रवास का आकलन करने के लिए एक उपयोगी सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है क्योंकि यह mimics ऊतक stroma की बुनियादी सुविधाओं और माइक्रोस्कोपी के कई रूपों के लिए उत्तरदायी है.
Abstract
सेल प्रवास जीव विज्ञान के विकास, घाव भरने, प्रतिरक्षा प्रणाली के सेलुलर प्रतिक्रियाओं, और ट्यूमर कोशिकाओं के मेटास्टेसिस सहित कई पहलुओं के लिए मौलिक है. प्रवासन कांच coverslips पर अध्ययन किया गया है क्रम में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा सेलुलर गतिशीलता की जांच करने के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए. हालांकि, यह स्पष्ट हो गया है कि सेल प्रवास के कई पहलुओं को स्थानीय पर्यावरण की अपनी लोच, प्रोटीन संरचना, और ध्यान में लीन होना आकार है, जो ईमानदारी से कठोर कांच और प्लास्टिक 1 के रूप में इस तरह के दो आयामी substrates द्वारा प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे सहित सुविधाओं पर निर्भर है. इसके अलावा, stromal 2 fibroblasts और प्रतिरक्षा 3 कोशिकाओं सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं, के साथ बातचीत के कैंसर की कोशिकाओं के आक्रमण को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है. आणविक स्तर पर जांच तेजी से पता चला है कि दवा उपचार के लिए समान कोशिकाओं की प्रतिक्रिया, सहित आणविक गतिशीलता, काफी अलग हैं जब तुलना
आदर्श रूप में, यह सबसे अच्छा होना अपने रहने वाले जीवों में स्वाभाविक रूप से होने वाली संदर्भ में सेल प्रवास का अध्ययन करेगा, लेकिन यह हमेशा संभव नहीं है. सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स, Matrigel, organotypic संस्कृति (यहाँ वर्णित) ऊतक explants, organoids, और xenografts के रूप में मध्यवर्ती टिशू कल्चर प्रणाली, इसलिए कर रहे हैं महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक मध्यवर्ती. Vivo वातावरण में एक के इन प्रणालियों के लगभग कुछ पहलुओं पर अधिक stably ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों, नशीली दवाओं के उपचार के शासनों, दीर्घकालिक और उच्च संकल्प इमेजिंग के उपयोग जैसे प्रयोगात्मक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी हैं. ऐसे मध्यवर्ती सिस्टम साबित जांच मान्य है और vivo में इमेजिंग 5 उपक्रम पहले कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से गतिशील प्रतिक्रिया की छवि के लिए आवश्यक मानकों की स्थापना के लिए आधार के रूप में विशेष रूप से उपयोगी हैं. जैसे, वे जीने पर प्रयोगों के लिए की जरूरत को कम करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा कर सकते हैंछ जानवरों.
Protocol
1. Fibroblast संस्कृतियों के त्वचा explants से स्थापना
- 4 मिमी पंच मानव प्रकोष्ठ से प्राप्त बायोप्सी सदस्य में रखा जाता है 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 / ग्राम मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.25 ग्राम / मिलीलीटर Fungizone पूरक.
- किसी भी वसा छाँटो और पतले छोटे टुकड़ों में एक नंबर पेट्री डिश के नीचे के खिलाफ 24 स्केलपेल ब्लेड का घोड़ा बायोप्सी काटना.
- जगह प्राथमिक fibroblast वृद्धि मीडिया (सदस्य FCS 10%, 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 / ग्राम मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 25 ग्राम / मिलीलीटर Fungizone पूरक) के साथ एक 25 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में ऊतक घोल कुप्पी की सतह तक लेकिन कवर तरल गहराई फ्लोट करने के लिए ऊतक के लिए अपर्याप्त है.
- 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 3 37 दिनों के ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस के बाद, प्राथमिक fibroblast वृद्धि मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ने.
- ताजा प्राथमिक fibroblast वृद्धि मीडिया के साथ एक और 3 दिन ऊष्मायन परिवर्तन मीडिया के बाद, या cel अगररास लगभग मिला हुआ है वे ताजा मीडिया में 01:04 विभाजित कर सकते हैं. (Fungizone इस बिंदु के बाद से छोड़ा जा सकता है).
2. मैं स्टेज - मैं कोलेजन के चूहे की पूंछ से तैयार
नोट: 12-14 लगभग किशोर (ताजा या फ्रोजन) चूहा पूंछ के लिए प्रोटोकॉल
- 70% इथेनॉल में धोने से चूहे की पूंछ तैयार है और tendons के रूप में निकालें:
- चूहे की पूंछ से ऊपर से पूंछ के बीच में टुकड़ा करने की क्रिया के साथ नीचे करने से त्वचा निकालें एक स्केलपेल और पूंछ की लंबाई के साथ pealing.
- पूंछ के समीपस्थ क्षेत्र के कोर से पट्टा अलग करें.
- म्यान दांतेदार संदंश का उपयोग कर से बचने के पूंछ के बाहर का क्षेत्र की ओर कण्डरा निकालें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए सरगर्मी से कण्डरा के 1 ग्राम / 0.5 एम एसिटिक एसिड की 250 मिलीलीटर निकालें.
- 30 मिनट के लिए (7500 XG) निकालने अपकेंद्रित्र और गोली त्यागें.
- तैरनेवाला के लिए 10% की एक समान मात्रा (w / v) NaCl जोड़ें, और 30-60 मिनट के लिए हलचल.
- की 6L 6-8 परिवर्तन के खिलाफ कोलेजन समाधान ~ 17.5 मिमी एसिटिक एसिड (1 मिलीग्राम ठंडे पानी के हिमनदों प्रति लीटर एसिटिक एसिड, 2 दैनिक x बदलाव) Dialyze.
- 1.5 घंटे के लिए 30,000 XG पर dialysed कोलेजन अपकेंद्रित्र.
- तैरनेवाला और बाँझ फ्लास्क में जगह निकालें.
- मैं ~ 2 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता 4 में 0.5 मिमी एसिटिक एसिड का उपयोग ° सी. कोलेजन समायोजित
3. स्टेज द्वितीय - एम्बेडेड fibroblasts (8 दिनों के लिए अनुबंध करने की अनुमति देते हैं) के साथ 3 डी मैट्रिक्स की स्थापना.
- एक पूर्व ठंडा बोतल में 4 में ठंड अभिकर्मकों डिग्री सेल्सियस का प्रयोग कर रहा है मिश्रण को इकट्ठा करो. कोलेजन मैं बर्फ पर रखें.
- T75 एक सहधारा प्राथमिक fibroblasts की कुप्पी (~ सेल संख्या 1 x 10 6) का उपयोग करें:
- 25 मिलीलीटर चूहा पूंछ कोलेजन (लगभग सान्द्र 2mg/ml)
- 3 10x मिलीलीटरसदस्य
- 0.22 एम NaOH: 1, 2ml, तो बूंद - वार whilst उद्दीपक, जब तक कोलेजन नारंगी हो जाता है,
- लेकिन (आमतौर पर 3 मिलीलीटर) गुलाबी नहीं है. लगभग एच पी = 7.2.
- नोट: यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मध्यम / तटस्थ या थोड़ा अम्लीय जेल के रूप में रहता fibroblasts जेल नहीं अनुबंध अगर में भी थोड़ा alkaline स्थितियों के लिए खुल जाएगा.
- Fibroblasts Trypsinise, 5 मिनट के लिए 400 XG में स्पिन और तैरनेवाला हटाने के.
- 5 मिनट के दौरान ऊपर स्पिन: 12 x 35 मिमी प्लास्टिक के बर्तन तैयार - आम तौर पर fibroblasts / कोलेजन मिश्रण की एक कुप्पी से 12 व्यंजन हासिल.
- 3 मिलीलीटर में FCS fibroblasts निलंबित और तुरंत कोलेजन मिश्रण करने के लिए जोड़ने और हलचल.
- प्लेट लगभग 2.5 मिलीग्राम / पकवान प्रति कोलेजन fibroblast जितना जल्दी संभव हो. कोलेजन और सेटिंग बुलबुले से बचने की कोशिश करें.
- चलो कोलेजन हवा में एक 5% सीओ 2 के humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए निर्धारित है.
- Fibroblast की 1ml बढ़ने जोड़ेंवें मीडिया (DMEM + 10% FCS).
- एक विंदुक का उपयोग पकवान की तरफ से मैट्रिक्स / कोलेजन fibroblast अलग करें.
- अगले दिन: fibroblast वृद्धि मीडिया (DMEM + 10% FCS) 1ml जोड़ें.
- मीडिया हर दूसरे दिन बदलें. लगभग 8 दिनों के लिए अनुबंध करने के लिए / कोलेजन fibroblast मैट्रिक्स की अनुमति दें, जब तक वे एक 24-अच्छी तरह से पकवान में फिट (~ व्यास में 1.5 सेमी 3.5 सेमी से संकुचन, 1 चित्र देखें).
नोट: कोलेजन एकाग्रता के लिए आवेदन के अनुरूप समायोजित किया जाना चाहिए. कोलेजन समाधान पतला, यह तेजी से fibroblasts द्वारा अनुबंधित किया जाएगा. कोलेजन के विभिन्न बैचों के साथ ही एकाग्रता में संकुचन दर में मामूली अंतर का अनुभव होगा. इसी प्रकार, विभिन्न संस्कृतियों fibroblast अलग दरों पर कोलेजन जैल अनुबंध, और अधिक fibroblasts उपस्थित, तेजी से संकुचन की दर. कोलेजन एकाग्रता और fibroblast घनत्व इसलिए द्वारा संकुचन की दर को संशोधित करने के लिए समायोजित कर सकते हैं,और कोलेजन जेल के अंतिम घनत्व.
4. स्टेज द्वितीय - मैट्रिक्स के शीर्ष पर चढ़ाना ब्याज की कोशिकाओं
नोट: इथेनॉल के साथ प्रयोग करने से पहले सभी उपकरण और संदंश जीवाणुरहित.
- कुंद संदंश का प्रयोग, धीरे 24 अच्छी तरह से पकवान अनुबंधित मैट्रिक्स चाल. सुनिश्चित करें कि यह गुना नहीं करता है.
- लगभग 4 x 10 मैट्रिक्स के शीर्ष पर 4 मिलीग्राम / और प्लेट 1ml (trypsinising स्पिन, कोशिकाओं trypsin से छुटकारा पाने के बाद) पर ब्याज की कोशिकाओं के निलंबन की तैयारी. जरूरत कोशिकाओं की वास्तविक संख्या सेल इस्तेमाल किया प्रकार के आधार पर अलग अलग होंगे. सेल मध्यम ब्याज की कोशिकाओं के लिए सामान्य मध्यम विकास होना चाहिए.
- कोशिकाओं मैट्रिक्स के शीर्ष पर, लगभग 3-5 दिन संगम के लिए विकसित करने की अनुमति दें.
5. स्टेज III - आक्रमण (0-21 दिन) के लिए एक ग्रिड मैट्रिक्स स्थानांतरित
- स्टेनलेस स्टील ग्रिड कट एक तिपाई बनाने और पहले आटोक्लेव उपयोग करने के लिए (चित्रा 2 देखें).
- बाँझ ग्रिड में जगह6 सेमी डिश, ग्रिड ऊपर एक स्तर (10.5ml लगभग) विकास मीडिया जोड़ने. ग्रिड पर प्लेस मैट्रिक्स और धीरे मीडिया aspirate तो मैट्रिक्स के नीचे मीडिया के साथ संपर्क में है, लेकिन नहीं जलमग्न. इस इंटरफ़ेस हवा / तरल है, जो एक ढाल है कि आक्रमण को बढ़ावा देता है बनाता के रूप में जाना जाता है. हर मध्यम दो दिन (2 चित्रा देखें) बदलें.
- सेल लाइव, प्रासंगिक इमेजिंग फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का उपयोग पहले या इस स्तर पर imaged किया जा सकता है. अनुबंध या तंतुमय कोलेजन मैं 2 हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी, 3 आंकड़ा देखें) का उपयोग imaged किया जा सकता है. बहु - फोटोन व्यापक क्षेत्र का पता लगाने के साथ संयुक्त उत्तेजना हम पाते कि एसएचजी मैट्रिक्स में कम से कम 100 सुक्ष्ममापी imaged कर सकते हैं, जबकि cytoplasmic GFP व्यक्त कोशिकाओं को कम से कम 200 मीटर गहरी imaged किया जा सकता का उपयोग.
नोट: आक्रमण की मात्रा का ठहराव के लिए सम्मान के साथ, दिन, जिस पर matricies ग्रिड पर रखा जाता है दिवस 0 को परिभाषित करता है. ग्रिड पर प्लेसमेंट सेल संस्कृति मीडिया के एक ढाल है कि आक्रमण int को बढ़ावा उत्पन्न मैट्रिक्स ओ. नमूने अगले 1 से अधिक imaged किया जा सकता है - आक्रमण, प्रसार, अस्तित्व, या भेदभाव (संदर्भ सूची देखें) के रूप में जैविक प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए 21 दिनों (या अब).
6. स्टेज चतुर्थ - फिक्सेशन
- एक बाज़ ट्यूब में 4% पीएफए के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
- एक सपाट सतह पर मैट्रिक्स स्थानांतरण. एक ताजा साफ स्केलपेल (जैसा कि आप पार अनुभाग धुंधला किया जाएगा) के साथ आधे में कट मैट्रिक्स, मैट्रिक्स स्केलपेल और 4% पीएफए के हस्तांतरण के साथ लिफ्ट, रात खत्म तय.
- Organotypic matrices अब एंटीबॉडी के साथ दाग / पसंद के दाग (3 चित्रा देखें) के लिए तैयार कर रहे हैं.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा fibroblast अनुबंधित fibroblast और चूहे की पूंछ पेट्री डिश से अलग है और 6-8 दिनों से अधिक अनुबंध करने की अनुमति दी कोलेजन कोलेजन मैं मिश्रण के उदाहरण 1.
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चित्रा 2 organotypic परख प्रगति. Organotypic सेट और प्रगति के एक योजनाबद्ध, बी, स्टेनलेस स्टील, बाँझ / हवा तरल इंटरफेस ग्रिड के शीर्ष पर मैट्रिक्स / कोलेजन fibroblast का उदाहरण.
Organotypic परख के 3 आवेदन चित्रा. ए, बी, गैर इनवेसिव और आक्रामक अग्नाशय ductal ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं (PDAC) organotypic मैट्रिक्स के साथ समय पर हमलावर सी, त्वचा एक fibroblast अनुबंधित collagenous त्वचीय घटक पर एक स्तरीकृत epidermis दिखा बराबर रह डी, C8161 मेलेनोमा कोशिकाओं हमलावर एक fibroblast collagenous त्वचीय बराबर ई, आक्रामक PDAC कोशिकाओं (हरा) fibroblasts (लाल) के साथ बातचीत और organotypic मैट्रिक्स के भीतर हमलावर अनुबंधित एफ.
Discussion
यहाँ हम एक 3 आयामी इनवेसिव सेल 6-8 प्रवास के अध्ययन के लिए उपयुक्त मैट्रिक्स के उत्पादन के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. मैट्रिक्स कोलेजन टाइप 1 तंतुओं, जो कई दिनों की अवधि में प्राथमिक मानव epidermal fibroblasts द्वारा अनुबंधित कर रहे हैं के होते हैं. कोलेजन एसिड निष्कर्षण, नहीं है, जो पाली पेप्टाइड सिरों पर जेट को बरकरार रखता है और कोलेजन तंतुओं के बफर 9 शर्तों के निराकरण पर बड़ा समुच्चय में पार से जोड़ने को बढ़ावा देता है enzymatic पाचन द्वारा तैयार किया जाता है. फिर से गठित की है जो और अधिक बारीकी से vivo में कोलेजन की सुविधाओं mimics और जैल में संवर्धित कोशिकाओं के आक्रामक गुणों के लिए महत्वपूर्ण परिणाम है एक जेल में यह परिणाम है. यह बात है कि ताजा या फ्रोजन शुरू सामग्री का इस्तेमाल किया जाता है नहीं है, करता है, लेकिन किशोर चूहे की पूंछ का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि कोलेजन पार से जोड़ने छोटे जानवरों में अधिक अस्थिर है. कोलेजन मैं छोटे जानवरों से इसलिए आसान है निकालने के, और w फिर से गठन कियाith उच्च निष्ठा.
मैट्रिक्स कोलेजन और तय किया जा सकता है या तो आक्रामक ट्यूमर कोशिकाओं या stromal fibroblasts 2,10 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ दाग और दवाओं जो 5,6 आक्रमण बाधित हो सकता है की प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए बहुत उपयोगी हैं.
हालांकि इस प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव त्वचा fibroblasts के उपयोग से पता चलता है, यह जांच के तहत ऊतक के प्रकार के अनुसार, अन्य प्रकार के ऊतक से प्राथमिक fibroblasts का उपयोग संभव है. यह भी संभव है कोशिकाओं जो stably किया गया है फ्लोरोसेंट प्रोटीन conjugates साथ ट्रांसफ़ेक्ट सहित अमर fibroblasts, का उपयोग संस्कृतियों स्थापित. इस तरह दोनों stromal और ट्यूमर कोशिकाओं 11 आक्रमण के दौरान सेल सेल बातचीत कल्पना करने के लिए नामांकित किया जा सकता है.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | GIBCO, by Life Technologies | 21430 | - |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
| FCS | PAA Laboratories | A15-101 | - |
| 35 mm dishes | Falcon BD | 353001 | For step 3.4 |
| 60 mm dishes | Falcon BD | 353004 | For step 5.2 |
| Spring forceps blunt | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | E003/02 | Toothed, not smooth |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
| Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma-Aldrich | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
| Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 - 14 kD |
| PBS | Oxford Labware | BR0014G | - |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | - |
| 24 well dish | Falcon BD | 353047 | For step 4.1 |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | - |
References
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion. Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).
- Patsialou, A. Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor. Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).
- Serrels, A. Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development. Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).
- Timpson, P. Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53. Cancer Res. 71, 747-757 (2011).
- Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. 4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors. Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).
- Fusenig, N. E. Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).
- Nystrom, M. L. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205, 468-475 (2005).
- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).
- Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation. Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).
