Summary
نحن تصف طريقة جديدة لزيادة الغلة من [كدنا] وحيدة الخلية كميات مرنا في مستوى ردود الفعل على خلاف ذلك المختبر النسخ العكسي. الجدة تكمن في استخدام micromixer ، الذي يستخدم لظاهرة microstreaming الصوتية ، لخلط السوائل في جداول ميكروليتر أكثر فعالية من الهز ، أو vortexing سحن.
Abstract
ويتم الربط بشكل مثالي مع سلوك التعبير الجيني على مستوى الخلايا وحيدة الخلية. ومع ذلك ، لم يتم تحقيق ذلك بسهولة لأن كمية صغيرة من مرنا عطوب موجودة في خلية واحدة (1-5 ٪ من الحمض النووي الريبي 1 - 50pg الكلي ، أو مرنا 0.01 - 2.5pg ، لكل خلية 1) قبل أن يحط في معظمها يمكن عكس كتب [كدنا] في نسخة مستقرة. على سبيل المثال ، باستخدام الكواشف المخبرية والأجهزة القياسية ، ويمكن أن يكون سوى عدد صغير من الجينات المقررة نوعيا في الخلية 2. وإحدى الطرق لزيادة كفاءة مستوى ردود الفعل العكسي المختبرات (RT) الناسخ (أي معيار الكواشف بكميات ميكروليتر) وحيدة الخلية تتألف من مبالغ ليكون مرنا بسرعة أكبر مزج الكواشف بحيث يمكن تحويلها إلى مرنا [كدنا] قبل أن يتحلل. لكن هذه ليست تافهة لأن في موازين ميكروليتر تدفق السائل الصفحي ، أي الطرق المتاحة حاليا من الاختلاط (أي الهز ، وسحن vortexing) تفشل لانتاج الحركة الفوضوية بفعالية كافية لخلط الكواشف. لحل هذه المشكلة ، الصغيرة الحجم تقنيات الخلط يجب أن تستخدم 3،4. وقد تم تطوير عدد من التكنولوجيات المستندة ميكروفلويديك الاختلاط الذي زيادة غلة رد فعل بنجاح RT 5-8. ومع ذلك ، والتكنولوجيات على microfluidics تتطلب أجهزة متخصصة مكلفة نسبيا والتي لا تتوافر حتى الآن على نطاق واسع. حل أرخص وأكثر ملاءمة هو مرغوب فيه. الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو لشرح كيفية تطبيق تقنية رواية "micromixing" لردود الفعل القياسية RT مختبر وحيد الخلية تضم كميات مرنا بشكل ملحوظ زيادة عائداتها [كدنا]. نجد زيادة غلة [كدنا] من قبل ما يقرب من 10 أضعاف - 100 ، التي تمكن : (1) عدد أكبر من الجينات لتحليلها في كل خلية ، (2) التحليل الكمي لمزيد من التعبير الجيني ، و (3) تحسين كشف منخفضة وفرة الجينات في الخلايا واحد. يستند على micromixing الصوتية microstreaming 9-12 ، حيث ظاهرة الموجات الصوتية نشر حول عقبة صغيرة خلق تدفق يعني قرب العقبة. طورنا الصوتية microstreaming المستندة إلى الجهاز ("micromixer") مع تبسيط المفتاح ، ويمكن تحقيقه microstreaming الصوتية على ترددات الصوت من خلال ضمان نظام يحتوي على واجهة الهواء السائل مع قليل من دائرة نصف قطرها 13 انحناء. في الغضروف المفصلي لحجم ميكروليتر من محلول في أنبوب يوفر نصف قطرها صغير مناسب للانحناء. استخدام الترددات السمعية يعني أن الأجهزة غير مكلفة ويمكن تنوعا 13 ، وليست معطوبة الأحماض النووية والكواشف الكيميائية الحيوية الأخرى مثل أنها يمكن أن تكون مع sonicators المختبر القياسية.
Protocol
1. Micromixing رد فعل RT
- قبل إجراء عملية تفاعل مع RT micromixing ، ويوازن micromixer إلى درجة الحرارة المطلوبة للتفاعل RT.
- ضع micromixer داخل 37 درجة مئوية (أو درجة الحرارة الموصى بها من قبل المورد RT) حاضنة لللا يقل عن 1 ساعة قبل ظهور رد فعل RT.
- إعداد مزيج RT وفقا لتجار وعكس الناسخ (مثل MMTV - RT من Promega ، Omniscript من Qiagen) تعليمات ، باستثناء المبالغ وحيدة الخلية استخدام مدخلات مجموع الحمض النووي الريبي (مثل 0.1-1pg/μl) ، بدلا من ميكروغرام NG - المبالغ الموصى بها من قبل الموردين.
- فإننا نستخدم عقيمة ، nuclease خالية 200μL رقيقة الجدران أنابيب PCR.
- موقف أنابيب RT آمن في micromixer حالما تكون جاهزة للخلط. يجب أن تبقى داخل micromixer الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة رد الفعل RT.
- حدد التردد والسعة المناسبة لmicromixing. في هذا المثال نستخدم 150Hz.
- تبديل micromixer على وتركه لمدة يوم كامل للتفاعل RT (60 دقيقة).
- تبديل micromixer قبالة واتخاذ RT أنابيب لمرة وتفاعل RT كاملة.
- وضع أنابيب RT على الجليد والمضي قدما كما هو معتاد مع تطبيقات أخرى مثل كمية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR qPCR أو في الوقت الحقيقي).
2. ممثل النتائج :
صالح micromixing في سياق ردود الفعل RT هو زيادة في الغلة [كدنا] بالنسبة إلى عندما تستخدم أساليب خلط الأخرى (الهز على سبيل المثال ، أو vortexing سحن). ويمكن رؤية هذا ، على سبيل المثال ، بناء على تحليل لاحقة من استخدام كمية [كدنا] تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR qPCR أو في الوقت الحقيقي). ويوضح الشكل 2A آثار micromixing لأول 5 دقائق (الأزرق "، micromixed5") أو في كل 60 دقيقة (أحمر "، micromixed60") بالمقارنة مع سحن للتفاعل RT مباشرة قبل الحضانة RT (أسود "هرس" ). في هذه الحالة كان حجم رد الفعل RT 25μL السابقة والواردة من الحمض النووي الريبي 2.5pg الإجمالي. وتظهر آثار qPCR باستخدام بادئات مصممة للكشف عن [كدنا] يمثلون Nurr مرنا - 1 أعلاه ، ويتم رسم يعني ± SEMS من عدد من الدورات للوصول إلى 50 ٪ كحد أقصى في 3 مضان يكرر هذه التجربة نفسها أدناه. النجمة ترمز إلى فروق ذات دلالة إحصائية (ANOVA في اتجاه واحد مع مقارنات متعددة توكي). علما بأن micromixing عن الدقائق ال 5 الأولى من رد فعل RT السابقة تنتج تحسنا كبيرا على غير سحن حين micromixing لل60 دقيقة كاملة من رد الفعل RT السابقة تنتج تحسنا كبيرا خلال سحن ، وحجم أي ما يعادل حوالي 15 qPCR دورات في المتوسط.
ويمكن أيضا الاستفادة من micromixing أن ينظر في تحليل منحنى ذوبان المنتجات qPCR اللاحقة التي حصل عليها. في التجربة أسفرت هو موضح في الشكل 2B ، micromixing لل60 دقيقة كاملة من رد الفعل RT السابقة في إشارة qPCR متسقة في عينات مكررة (2Ba الشكل (2) ، آثار الحمراء) ، في حين micromixing لأول 5 دقائق أو سحن تنتج سوى qPCR يتعارض آثار (الشكل 2Ba (2) ، آثار زرقاء وسوداء اثار 2 على التوالي). آثار سلبية الرمادية هي الضوابط ("NEG.") في [كدنا] الذي استبعد من رد الفعل qPCR. عندما كانت المنتجات qPCR من هذه التجربة من خلال زيادة درجة الحرارة متمسخ الخاصة بهم (أي تحليل منحنى ذوبان) كان واضحا أن المنتجات المناسبة PCR (أي amplicon التي تم مطابقة لتلك التي حصل عليها عندما كان يتم نقلها إلى عكس تركيزات أعلى بكثير من مرنا وتضخيمها من قبل qPCR ، وكانت البيانات لا تظهر) الحالي إلا بعد ردود الفعل التي كانت RT micromixed لمدة 60 دقيقة (الشكل 2Bb (2) ، آثار الحمراء). كل الآخرين (أي micromixed5 ، سحن والضوابط السلبية) ولدت amplicon المنتجات البديلة (dimers التمهيدي مثلا).
الشكل 1. مخطط تدفق بروتوكول لتطبيق معيار micromixing إلى ردود فعل RT المختبر. يتم توفير وصف أكثر تفصيلا لمبدأ المشاركة الفعلية ، micromixer وكيفية بناء micromixer في منزل في المراجع 13،14
الشكل 2. qPCR الممثل البيانات التي توضح فوائد micromixing تطبيقها على ردود الفعل السابقة RT حيدة الخلية تضم كميات قياسية مرنا في ذلك ردود الفعل RT المختبر. qPCR مثال على اثار الكشف عن [كدنا] مرنا تمثل ترميز Nurr - 1 الجينات. تضمنت ردود الفعل السابقة RT 2.5pg من الحمض النووي الريبي في إجمالي حجم 25μL وأجريت في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. وتباينت ردود الفعل من قبل RT سحن من Rمزيج T قبل الحضانة (آثار سوداء "هرس") ، micromixed خلال الدقائق ال 5 الأولى من رد فعل RT (آثار زرقاء "، micromixed5") أو لmicromixed 60 دقيقة كاملة من رد الفعل RT (آثار أحمر "micromixed60" ). يتم رسم يعني ± SEMS عدد دورات qPCR المطلوبة لتصل إلى 50 ٪ كحد أقصى مضان أدناه للحصول على ن = 3 من تكرار هذه التجربة. النجمة يشير إلى وجود اختلاف كبير (في اتجاه واحد أنوفا مع مقارنات متعددة توكي). باء آخر تجربة qPCR فحص المنتج Nurr - 1 [كدنا] ، وهذه المرة التالية التي تحتوي على ردود الفعل RT 25pg من الحمض النووي الريبي في إجمالي حجم 25μL. آثار qPCR (أ) فضلا عن تحليل منحنى ذوبان من المنتجات التي تم الحصول عليها qPCR (ب) تعرض لظروف اختلاط مختلفة. كما تتضمن الضوابط السلبية التي لم يدرج [كدنا] في التفاعل RT السابقة (آثار الرمادية "NEG"). وأجريت أيضا ردود فعل RT مع تركيزات أعلى بكثير من قمم مرنا وأنتجت منحنى ذوبان (لا تظهر البيانات) مماثلة لتلك التي في (ب) العينات (آثار أحمر) لmicromixed60.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ووصف طريقة تطبيق معيار micromixing إلى ردود فعل RT مختبر هنا يمكن ، بطبيعة الحال ، ينطوي مرنا تحصد عبر أي وسيلة (مثل انحلال الخلايا الطبيعية الليزر ، microdissection). يمكن أن تشمل أيضا أية علامات أو أنواع الكواشف RT ، أي درجة الحرارة (في التسامح من المواد من micromixer) ، ولأي فترة من الزمن. على سبيل المثال ، لاحظنا تحسن غلة [كدنا] من ردود الفعل التي تضم RT مسدوس عشوائي أو الشعائل بنسبة ضئيلة من DT. قد يكون أيضا أن تطبق على التحولات الكيميائية الحيوية الأخرى (مثل تهجين الحمض النووي 15) مطابقة للقيود التالية. العائق الرئيسي لهذا الأسلوب الحالي هو رد فعل يجب أن تحدث داخل قطرة (ميكروليتر) صغيرة من أشكال الحل الذي منحني السائل في الهواء واجهة (مثل هلالة). نستخدم عادة كميات من 10 أو 25μL في 200μL PCR أنابيب رقيقة الجدران ، وتنتج هلالات مع كعبرة للانحناء 4.7 أو 6.9mm ، على التوالي. هذا هو مطلب عام لتدفق الدوامة التي ستنشأ في هذا التراجع ، الذي يطيل التفاعل بين مختلف الحلول ويسمح نشرها لتتم خلال فترات زمنية أقصر. ينطبق هذا القيد ولذلك على جميع الحالات التي يمكن أن تستخدم micromixing. بل يمكن استخدام كميات صغيرة يكون ميزة في كثير من الأحيان بسبب يقتصر كمية المواد الإدخال (مثل الجيش الملكي النيبالي ، الحمض النووي) ، بالإضافة إلى أن تتمكن من إجراء تحقيق وفورات كبيرة في الكواشف الأخرى. في السياق المحدد لتحسين غلة رد فعل RT ، يجب أن تشمل أيضا رد فعل على كمية الحد من مرنا. وقد أظهرت لنا أن micromixing القياسية المختبر RT تفاعلات وحيدة الخلية تضم كميات من الحمض النووي الريبي إدخال زيادة الغلة من [كدنا] بحوالي 10 ضعفا أكثر من 100 من الأساليب القياسية خلط (الهز ، أو vortexing سحن) ، بما في ذلك جينات أخرى من Nurr 1 - موضح هنا 14. لقد أظهرنا أيضا هذا التحسن كما يقلل من تركيز الحمض النووي الريبي إدخال زيادات 14. يفترض هذا لأن بتركيزات أعلى الحمض النووي الريبي ، وزيادة معدل الانتشار في غياب micromixing يضمن تحويلها إلى أكثر مرنا [كدنا] قبل أن يتحلل.
سوف يستفيد من طريقة micromixing عالية الدقة انتقال الإشارات الصوتية من خلال وعاء التفاعل في حل التفاعل. ساعدنا تحقيق ذلك من خلال تشكيل الحذر من الثقوب الاختلاط في لوحة اكريليك المغطي للمتكلمين (الشكل رقم 1) بحيث كانوا مدبب لتناسب بالضبط 200μL رقيقة الجدران أنابيب PCR المستخدمة. هذا مكبر للاتصال بين وأنابيب لوحة اكريليك وبالتالي انتقال مكبر للإشارة الصوتية. يحتاج المرء أيضا لضمان أن يتم عقد آمن أنابيب رد فعل داخل الثقوب خلط لأنها يمكن أن تأتي من خلال خلط نتيجة الاهتزازات الميكانيكية.
تعريفنا للmicrostreaming الصوتية أوسع ربما من بعض التعاريف phenomenologically مقرا لها. ومع ذلك ، هناك مراجعة جيدة من قبل رايلي 16 التي تصنف هذه التدفقات في الأساس ، بدلا من phenomenologically. مصطلح غير الخطية في المعادلة نافيير ستوكس أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية بحيث في الدرجة الثانية هناك تدفقا يعني. منذ ذلك المصطلح مرات سرعة التدرج السرعة ، أي شيء يمكننا القيام به لجعل مقياس طول مدى السرعة التي تختلف صغيرة بما فيه الكفاية (أي جعل التدرج سرعة كبيرة بما فيه الكفاية) يمكن أن تؤدي إلى تدفق microstreaming. لدينا الصوتية microstreaming المستندة إلى الجهاز ("micromixer") تمكن microstreaming الصوتية على ترددات (أي انخفاض القوة) الصوت من خلال ضمان نظام يحتوي على واجهة الهواء السائل مع قليل من دائرة نصف قطرها 13 انحناء. في المقابل ، "تدفق الصوتية" التي غالبا ما يتم تعريف مصطلح غير الخطية التي أدلى كبيرة من السرعة الكبيرة (أي قوة عالية). في حالتنا ، يرصد انخفاضا صغيرا في بئر إلى التأرجح ، والتوتر السطحي للانخفاض ، جنبا إلى جنب مع اللزوجة ، قد تلعب دورا في خلق تدفق يعني مفيدة لخلط 13. وقد أظهرت التجارب أيضا أن يمكن نقل كبيرة (10 100μm) الجسيمات داخل قطرات أكبر من التذبذب التي نستخدمها ، ولكن هذا هو على الارجح من خلال آلية محددة لمختلف الجزيئات 17.
في الختام ، وتطبيق معيار micromixing إلى ردود فعل RT مختبر وحيد الخلية تضم كميات من الحمض النووي الريبي هو وسيلة فعالة لزيادة انتاجها بشكل كبير [كدنا]. هذا التحسن يفوق ما يمكن تحقيقه باستخدام الطرق المتاحة حاليا من وحدات التخزين ميكروليتر خلط (أي الهز ، أو vortexing سحن). على الرغم من أن هناك العديد من الظروف التي على microfluidics الأجهزة المستندة إلى الأداء RT سيكون بمثابة تقدم كبير ، في ظروف أخرى ، بما في ذلك منطقتنا ، micromixing حده يوفر فوائد كبيرة وكافية دون الحاجة لمزيد من المعدات المتخصصة والأساليب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما تكشف.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا (مشروع منحة رقم 6288480) وسكوبي وكلير الاستئماني ماكينون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus Bioscience | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega Corp. | C1181 | |
| AMV-RT | Promega Corp. | M5101 | |
| dNTP set | Promega Corp. | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega Corp. | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
References
- Livesey, F. J.
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N.
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
![زيادة غلال [كدنا] من خلية واحدة كميات مرنا في مختبر قياسي ردود الفعل الناسخ العكسي باستخدام Microstreaming الصوتية](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/3144.jpg)
