Summary
Мы описываем новый метод для повышения кДНК выход из одноклеточных количества мРНК в противном случае стандартного лабораторного реакции обратной транскрипции. Новизна заключается в использовании micromixer, которая использует явление акустической microstreaming, смешать жидкости на микролитр масштабах более эффективно, чем тряска, вортексе или растиранием.
Protocol
1. Микросмешения Реакция РТ
- Перед выполнением реакции РТ с микросмешения, равновесие micromixer до нужной температуры реакции РТ.
- Место micromixer внутри 37 ° С (или температуры, рекомендованной поставщиком RT) инкубатор, по крайней мере за 1 час до начала реакции РТ.
- Настройка смесь РТ по обратной транскриптазы поставщиком (например, MMTV-РТ от Promega, Omniscript от Qiagen) инструкции, за исключением использования одноклеточных количество входных общей РНК (например, 0.1-1pg/μl), вместо того, нг-мкг суммы, рекомендованные поставщиками.
- Мы используем стандартные стерильные, без нуклеазы 200 мкл тонкостенные пробирки для ПЦР.
- Позиция RT трубы надежно в micromixer, как только они будут готовы для смешивания. Micromixer должны оставаться внутри 37 ° C инкубатор для продолжительности реакции РТ.
- Выберите соответствующую частоту и амплитуду микросмешения. В этом примере мы используем 150 Гц.
- Переключатель на micromixer и оставьте на весь период реакции RT (60 минут).
- Коммутатор micromixer выходные и принять RT трубы один раз реакция РТ завершена.
- Место RT трубы на льду и продолжать как обычно с дальнейшими приложениями, такими как количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР или ПЦР в реальном времени).
2. Представитель Результаты:
Благо микросмешения в контексте реакции РТ увеличение кДНК доходность по сравнению с другими, когда смешение методов (например, дрожь, вортексе или растирания) используются. Это видно, например, при последующем анализе кДНК с использованием количественных полимеразной цепной реакции (КПЦР или ПЦР в реальном времени). Рисунок 2А показывает последствия микросмешения за первые 5 минут (синий, "micromixed5") или всего 60 минут (красный, "micromixed60") по сравнению с растирания реакции RT непосредственно перед инкубацией РТ (черный, "растирание" ). В этом случае объем предыдущего реакции РТ было 25 мкл и в нем 2.5pg от общего числа РНК. КПЦР следы использованием праймеров, предназначенный для обнаружения кДНК представляющего Nurr-1 мРНК показано выше, а средние значения ± SEMs числа циклов для достижения 50% максимальной флуоресценции в 3-х повторений этого же эксперимента приведены ниже. Звездочка означает статистически значимых различий (в одну сторону дисперсионного анализа с Тьюки множественных сравнений). Обратите внимание, что микросмешения в течение первых 5 минут предыдущего реакции РТ производится незначительное улучшение по сравнению с растиранием в то время как микросмешения в течение всего 60 минут предыдущего реакции РТ производится значительное улучшение по сравнению с растиранием, величина которого была эквивалентна примерно 15 КПЦР циклов, в среднем.
Благо микросмешения также можно рассматривать в кривой плавления анализ последующих продуктов КПЦР получены. В эксперименте показано на рис 2B, микросмешения в течение всего 60 минут предыдущего реакции РТ в результате последовательного сигнала КПЦР в двух экземплярах образцов (рис. 2Ва, 2 красные следы), в то время как микросмешения в течение первых 5 минут или растирания производятся только несовместимы КПЦР следов (рис. 2Ва, 2 синих трасс и 2 черных следов, соответственно). Серые следы негативного контроля ("нег."), В котором кДНК осталась вне КПЦР реакции. Когда КПЦР продукты из этого эксперимента были денатурированного по наращивает их температуры (т.е. кривая плавления анализа) было очевидно, что соответствующие продукты ПЦР (т.е. ампликона, которая была идентична, что получается, когда более высокие концентрации мРНК обратной транскрипции и усиливается КПЦР, данные не приводятся) присутствовали только следующие реакции РТ, которые были micromixed в течение 60 минут (рис. 2BB, 2 красные следы). Все остальные (т.е. micromixed5, растиранием и отрицательный контроль), порожденный альтернативных продуктов ампликона (например, димеры праймеров).
Рисунок 1. Принципиальная схема протокола для применения микросмешения к стандартным лабораторным РТ реакций. Более подробное описание физического принципа участие, micromixer и как построить в доме micromixer предоставляются в ссылках 13,14
Рисунок 2. Представителю КПЦР данные, иллюстрирующие преимущества микросмешения применяется к предыдущему РТ реакции включает одноклеточные количества мРНК в противном случае стандартного лабораторного реакции РТ. Пример КПЦР следов обнаружения кДНК представляющего мРНК, кодирующей Nurr-1 гена. Предыдущий реакции РТ, содержащихся 2.5pg от общего числа РНК в объеме 25 мкл и проводились в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 60 минут. RT реакции перемешивается растирания RТ смесь до инкубации (черные следы ", растиранием"), micromixed в течение первых 5 минут реакции RT (синие следы ", micromixed5") или micromixed в течение всего 60 минут реакции RT (красные следы ", micromixed60" ). Средства ± SEMs числа КПЦР циклов, необходимых для достижения 50% максимальной флуоресценции приведены ниже для п = 3 повторяет этого эксперимента. Asterisk указывает на значительную разницу (в одну сторону дисперсионного анализа с Тьюки множественных сравнений). В другом эксперименте КПЦР изучения Nurr-1 кДНК продукт, на этот раз следующие РТ реакции содержащие 25pg от общего числа РНК в объеме 25 мкл. КПЦР следы (), а также кривая плавления анализ продуктов КПЦР получены (б) показаны для различных условий перемешивания. Отрицательного контроля, в которых не кДНК была включена в предыдущий реакции РТ также включены (серые следы ", нег."). RT реакции с гораздо более высокой концентрации мРНК были выполнены также и производится кривой плавления пиков (данные не приведены) идентичны тем, которые в (б) для micromixed60 (красные следы) образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод применения микросмешения к стандартным лабораторным РТ реакции, описанные здесь, могут, конечно, связаны с мРНК собраны с помощью любого метода (например, лизиса клеток, лазерная захвата микродиссекции). Он также может содержать любой марки или типа РТ реагентов, любой температуре (в пределах допуска материалов micromixer), и любой период времени. Например, мы наблюдаем улучшение кДНК состава из реакций РТ включающий случайные гексамера или олиго-дТ праймеров. Она также может быть применена к другим биохимических превращений (например, ДНК-гибридизации 15) в соответствии со следующими ограничениями. Основным ограничением текущего техника реакция должна происходить в небольших (микролитр) каплю раствора, который формирует изогнутые жидкость-воздух (например, мениска). Мы регулярно использовать тома из 10 или 25 мкл в 200 мкл тонкостенных труб ПЦР, производя менисков с радиусами кривизны 4.7 или 6.9mm, соответственно. Это общее требование для вихревого потока, который будет создан в капле, которая удлиняет интерфейс между различными решениями и позволяет диффузии пройдет в более короткие сроки. Это ограничение поэтому относится ко всем ситуациям, в которых микросмешения могут быть использованы. Действительно использование небольших объемах может быть преимуществом, потому что часто количество исходного материала (например, РНК, ДНК) ограничен, а также значительную экономию можно сделать на других реагентов. В конкретном контексте повышения урожайности РТ реакция, реакция должна включать также предельный объем мРНК. Мы показали, что микросмешения стандартного лабораторного РТ реакции включает одноклеточные количество входных РНК увеличивает их кДНК доходность примерно на 10 100 раз по сравнению со стандартными методами смешения (тряска, вортексе или растирания), в том числе гены, кроме Nurr-1 иллюстрирует здесь 14. Мы также показали, что это улучшение уменьшается концентрация ввода РНК увеличивается 14. Предположительно это происходит потому, что при более высоких концентрациях РНК, увеличение скорости диффузии в отсутствие микросмешения обеспечивает более мРНК превращается в кДНК, прежде чем он деградирует.
Микросмешения метод выиграют от высококачественного передачи звукового сигнала через реакционный сосуд для реакционного раствора. Мы помогли достичь этого, осторожно обработки смешивание отверстий в акриловой пластины вышележащих динамики (рис. 1), что они были конические, чтобы точно соответствовать 200 мкл тонкостенные пробирки для ПЦР используется. Это максимальный контакт между трубками и акриловых пластин и, следовательно, максимальную передачу звукового сигнала. Кроме того, нужно убедиться, что реакция трубы надежно удерживаются в пределах смешивания дыры, потому что они могут выйти во время смешивания в результате механических колебаний.
Наше определение акустических microstreaming, возможно, более широкие, чем некоторые феноменологически основе определений. Однако, есть хороший обзор от 16 Райли, которая классифицирует эти потоки принципиально, а не феноменологически. Нелинейного члена в уравнении Навье-Стокса должна быть достаточно большой, так что на второго порядка есть среднее течение. Так как этот термин скорость раз градиента скорости, что мы делаем, чтобы масштаб длины, над которой скорость меняется достаточно малым (т.е. сделать градиент скорости достаточно велико) может привести к microstreaming потока. Наши акустические microstreaming устройство на базе ("micromixer") позволяет акустической microstreaming на аудио (т.е. малой мощности) частотах, обеспечивая системе жидкость-воздух с малым радиусом кривизны 13. В отличие от "акустического течения" часто определяется нелинейного члена, который сделан большой на большой скорости (например, высокая мощность). В нашем случае, маленькая капля в хорошо сделан колебаться, поверхностное натяжение капли, вместе с ее вязкость, могут играть роль в создании среднего течения полезно для смешивания 13. Эксперименты также показали, что большие (10-100 мкм) частицы могут быть перемещены в более крупные капли вибрирует, чем мы пользуемся, однако это, вероятно, по другому механизму, характерные для частиц 17.
В заключение, применение микросмешения к стандартным лабораторным РТ реакции включает одноклеточные количество РНК эффективный способ значительно увеличить их доходность кДНК. Это улучшение сверх того, что можно достичь с помощью имеющихся в настоящее время методов смешивания объемов мкл (например, дрожь, вортексе или растирания). Хотя Есть много обстоятельств, при которых микрофлюидики устройств на основе выполнения РТ будет большой шаг вперед, при иных обстоятельствах, включая нашу собственную, микросмешения только обеспечивает значительные выгоды и адекватное, без необходимости дальнейшего специализированного оборудования и методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего разглашать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (проект грант №. 6288480) и Скоби и Клэр МакКиннон Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus Bioscience | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega Corp. | C1181 | |
| AMV-RT | Promega Corp. | M5101 | |
| dNTP set | Promega Corp. | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega Corp. | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
References
- Livesey, F. J.
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N.
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
