Ökad cDNA Avkastningen från encelliga Mängder av mRNA i Standard transkriptas Laboratory Omvänd Reaktioner med akustiska Microstreaming

Summary

Vi beskriver en ny metod för att öka cDNA avkastningen från encelliga mängder av mRNA i övrigt standard transkription laboratorium omvända reaktioner. Det nya finns i användandet av en micromixer, som utnyttjar fenomenet akustiska microstreaming, att blanda vätskor på mikroliter skalor mer effektivt än skakningar, vortexa eller trituration.

Abstract

Korrelera genuttryck med cellens beteende är idealiskt sker på encelliga nivå. Detta är dock inte lätt att uppnå eftersom den lilla mängd labila mRNA som finns i en enda cell (1-5% av 1-50pg totala RNA, eller 0,01-2.5pg mRNA, per cell ¹⁾ mestadels degraderar innan det kan vända transkriberas till en stabil cDNA kopia. Till exempel med vanliga laboratoriereagenser och hårdvara, kan bara ett litet antal gener vara kvalitativt bedömas per cell ^2. Ett sätt att öka effektiviteten i vanliga laboratorium omvänt transkriptas (RT) reaktioner (dvs standardreagens i mikroliter volymer) som består av encelliga mängder av mRNA skulle vara att snabbare blanda reagenser så mRNA kan omvandlas till cDNA innan det bryts ned. Men detta är inte trivialt eftersom vid mikroliter skalor vätskeflödet är laminärt, dvs för närvarande tillgängliga metoder för att blanda (dvs skakningar, vortexa och trituration) misslyckas med att producera tillräckligt kaotisk rörelse för att effektivt blanda reagenser. För att lösa detta problem, mikro-skala blanda tekniker måste användas ^3,4. Ett antal av mikrofabricerade-baserad blandning har utvecklats som framgångsrikt öka RT reaktion ger ^5-8. Men mikrofluidik teknik kräver specialiserad hårdvara som är relativt dyra och ännu inte allmänt tillgängliga. Ett billigare, bekvämare lösning är önskvärd. Huvudsyftet med denna studie är att visa hur tillämpningen av en roman "micromixing" teknik för att standarden laboratorium RT reaktioner som består av encelliga mängder av mRNA väsentligt ökar deras cDNA avkastning. Vi finner cDNA skördarna öka med cirka 10 100 gånger, vilket gör att: (1) ett större antal gener som skall analyseras per cell, (2) mer kvantitativ analys av genuttryck, och (3) bättre upptäckt av låg-överflöd gener i enstaka celler. Den micromixing är baserad på akustiska microstreaming ^9-12, ett fenomen där ljudvågor sprida runt en liten hinder skapar en medelflödeshastighet nära hindret. Vi har utvecklat en akustisk microstreaming-baserad enhet ("micromixer") med en nyckel förenkling, akustiska microstreaming kan uppnås på ljudfrekvenser genom att systemet har en flytande luft-gränssnittet med en liten böjningsradie ^13. Menisken av en mikroliter volym lösning i ett rör ger en tillräckligt liten radie. Användningen av ljudfrekvenser innebär att hårdvaran kan vara billig och mångsidig ¹³ och nukleinsyror och andra biokemiska reagens inte är skadade som de kan vara med standard laboratorie sonicators.

Protocol

1. Micromixing en RT Reaktion

1. Innan du utför en RT reaktion med micromixing, balansera den micromixer till önskad temperatur RT reaktion.
   1. Placera micromixer inuti en 37 ° C (eller den temperatur som rekommenderas av RT leverantören) inkubator i minst 1 timme före starten av RT reaktion.
2. Ställ upp RT mixen enligt omvänt transkriptas leverantörens (t.ex. MMTV-RT från Promega, Omniscript från Qiagen) instruktioner, använd encelliga mängder indata totala RNA (t.ex. 0.1-1pg/μl), istället för ng-mikrog mängder som rekommenderas av leverantörer.
   1. Vi använder vanliga sterila, nukleasfritt 200μL tunnväggiga PCR-rör.
3. Position RT rör ordentligt i micromixer så snart de är redo för mixning. Den micromixer bör vara inne i 37 ° C inkubator för den tid RT reaktion.
4. Välj rätt frekvens och amplitud micromixing. I detta exempel använder vi 150Hz.
5. Slå på micromixer på och lämna den på under hela den RT reaktionen (60 minuter).
6. Stäng av micromixer av och ta RT rören ut när RT reaktionen är klar.
7. Placera RT rören på is och fortsätt som vanligt med ytterligare applikationer såsom kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR eller realtids-PCR).

2. Representativa resultat:

Fördelen med micromixing i samband med RT reaktioner är en ökning av cDNA avkastningen i förhållande till när andra blandar metoder (t.ex. skakningar, vortexa eller trituration) används. Detta kan ses till exempel vid senare analys av cDNA med hjälp av kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR eller realtids-PCR). Figur 2a illustrerar effekterna av micromixing de första 5 minuterna (blå, "micromixed5") eller hela 60 minuter (röd, "micromixed60") jämfört med trituration av RT reaktionen omedelbart före RT inkubationen (svart, "trituration" ). I detta fall volymen av föregående RT reaktion var 25μL och den innehöll 2.5pg av totala RNA. qPCR spår med hjälp av primers för att upptäcka cDNA representerar Nurr-1 mRNA visas ovan, och de medel ± SEM av antalet cykler för att nå 50% maximal fluorescens i 3 rapporter av samma experiment plottas nedan. Asterisken anger en statistiskt signifikant skillnad (envägs ANOVA med Tukey multipla jämförelser). Observera att micromixing de första 5 minuterna av föregående RT reaktionen producerade en icke-signifikant förbättring jämfört trituration medan micromixing för hela 60 minuter av de föregående RT reaktion gav en signifikant förbättring jämfört trituration, omfattningen av vilket motsvarade cirka 15 qPCR cykler, i genomsnitt.

Fördelen med micromixing kan också ses i smältande kurva analys av efterföljande fått qPCR produkter. I experimentet visas i figur 2B, micromixing för hela 60 minuter av de föregående RT reaktionen resulterade i ett konsekvent qPCR signal i två exemplar prover (Figur 2BA, 2 röda spår), medan micromixing de första 5 minuter eller trituration bara produceras inkonsekvent qPCR spår (figur 2BA, 2 blå spår och 2 svarta spår, respektive). De grå spår är negativa kontroller ("neg.") Där cDNA var kvar utanför qPCR reaktion. När qPCR produkter från detta försök är denaturerad med ramp deras temperatur (dvs. smältande kurva analys) var det uppenbart att lämpliga PCR-produkter (dvs en amplicon som var identisk med den som erhålls när mycket högre koncentrationer av mRNA var omvänd transkriberas och förstärks av realtids-PCR uppgifter visas inte) var närvarande endast efter RT reaktioner som hade micromixed i 60 minuter (Figur 2BB, 2 röda spår). Alla de andra (dvs micromixed5, trituration och negativa kontroller) genereras alternativ amplicon produkter (t.ex. primer dimers).

Figur 1. Flödesschema av protokollet för tillämpning av micromixing till standard laboratorium RT reaktioner. Mer detaljerade beskrivningar av de inblandade fysiska princip micromixer och hur man bygger en egen micromixer finns i referenserna ^13,14

Figur 2. Representant qPCR uppgifter som illustrerar fördelarna med micromixing tillämpas på föregående RT reaktioner som består av encelliga mängder av mRNA i övrigt standard laboratorium RT reaktioner. A Exempel qPCR spår upptäcka cDNA representerar mRNA som kodar för Nurr-1 genen. De föregående RT reaktioner innehöll 2.5pg av totala RNA i en volym av 25μL och utfördes i en inkubator vid 37 ° C i 60 minuter. RT reaktioner var blandade med trituration i RT mix före inkubationen (svarta spår, "trituration"), micromixed under de första 5 minuterna av RT reaktion (blå spår, "micromixed5") eller micromixed för hela 60 minuter av RT reaktion (rött spår, "micromixed60" ). Medel ± SEM av antalet qPCR cykler krävs för att nå 50% maximal fluorescens ritas nedan för n = 3 rapporter av detta experiment. Asterisk indikerar en signifikant skillnad (envägs ANOVA med Tukey multipla jämförelser). B annan qPCR experiment undersöka Nurr-1 cDNA produkter, denna gång efter RT reaktioner innehåller 25pg av totala RNA i en volym av 25μL. qPCR spår (ett) samt smälter kurva analys av de erhållna qPCR produkter (b) visas för de olika blandning förhållanden. Negativa kontroller där ingen cDNA ingick i föregående RT reaktionen ingår också (grå spår, "neg."). RT reaktioner med mycket högre koncentrationer av mRNA utfördes också och producerade toppar smälter kurvan (data visas inte) identiska med de i (b) för micromixed60 (rött spår) prover.

Discussion

Metoden för tillämpning av micromixing till standard laboratorie RT reaktioner som beskrivs här kan naturligtvis innebära mRNA skördade via någon metod (t ex cellslys, laser fånga microdissection). Det kan också uppvisa några märken eller typer av RT reagenser, alla temperaturer (inom tolerans av materialen i micromixer), och varje tidsperiod. Till exempel har vi observerade förbättrats cDNA avkastningen från RT reaktioner som består av slumpmässigt hexamer eller oligo-dT primer. Det kan även tillämpas på andra biokemiska förändringar (t ex DNA-hybridisering ¹⁵⁾ som överensstämmer med följande begränsningar. Den viktigaste begränsningen i den nuvarande tekniken är reaktionen måste ske inom en liten (mikroliter) droppe av lösning som bildar en böjd flytande luft gränssnitt (t.ex. en menisk). Vi använder rutinmässigt volymer av 10 eller 25μL i 200μL tunnväggiga PCR-rör, producerar menisker med radier på 4,7 eller 6.9mm, respektive. Detta är ett allmänt krav på en virvel flöde som skall inrättas i nedgången, som förlänger gränssnittet mellan olika lösningar och tillåter diffusion ske under kortare tidsskalor. Denna begränsning gäller därför alla situationer där micromixing kan användas. Faktum är att användningen av små volymer kan vara en fördel eftersom det ofta den ingående material (t.ex. RNA, DNA) är begränsad, plus betydande besparingar kan göras på andra reagenser. I det specifika sammanhang för att förbättra RT reaktion avkastningen, måste reaktionen utgör också en begränsning av mängden av mRNA. Vi har visat att micromixing standard laboratorium RT reaktioner som består av encelliga mängder av input RNA ökar deras cDNA avkastningen med cirka 10 100 gånger jämfört med vanliga metoder för att blanda (skaka, vortexa eller trituration), även för gener än Nurr-1 illustreras här ^14. Vi har också visat denna förbättring minskar när koncentrationen av indata RNA ökar ^14. Förmodligen beror detta på att vid högre RNA-koncentrationer, ser den ökade spridningen i avsaknad av micromixing mer mRNA omvandlas till cDNA innan det bryts ned.

Den micromixing Metoden kommer att gynnas av hifi-överföring av akustisk signal genom reaktionskärlet att reaktionen lösningen. Vi hjälpte uppnå detta genom en noggrann bearbetning av blandningen hålen i akryl plattan överliggande högtalarna (Figur 1) så att de var avsmalnande att exakt passa 200μL tunnväggiga PCR användes rör. Detta maximerad kontakten mellan rören och akryl plattan och därmed maximeras överföring av akustisk signal. Man måste också se till att reaktionsrören säkert hålls inom den blandning hålen eftersom de kan komma ut under blandning som en följd av mekaniska vibrationer.

Vår definition av akustiska microstreaming är kanske bredare än vissa fenomenologiskt-baserade definitioner. Men det finns en bra recension av Riley ¹⁶ som klassificerar dessa flöden i grunden, snarare än fenomenologiskt. Den olinjära termen i Navier-Stokes ekvation måste vara stora nog så att vid den andra för det är ett medelvärde flöde. Eftersom denna term en hastighet gånger en hastighet lutning, allt vi göra för att göra längdskala över vilken hastighet varierar tillräckligt liten (dvs göra hastigheten gradienten tillräckligt stor) kan ge upphov till en microstreaming flöde. Vår akustiska microstreaming-baserad enhet ("micromixer") gör akustiska microstreaming på ljud (dvs låg effekt) frekvenser genom att systemet har en flytande luft-gränssnittet med en liten böjningsradie ^13. Däremot "akustisk strömning" definieras ofta av en olinjär term som görs stort av en stor hastighet (dvs hög effekt). I vårt fall är en liten droppe i ett välgjort att oscillera, ytspänningen i nedgången, tillsammans med dess viskositet, kan spela en roll för att skapa en medelflödeshastighet användbar för blandning ^13. Experiment har också visat att stora (10-100μm) partiklar kan flyttas inom större vibrerande droppar än vi använder, men detta är troligen genom en annan mekanism som är specifik för partiklar ^17.

Sammanfattningsvis är tillämpningen av micromixing till standard laboratorie RT reaktioner som består av encelliga mängder av RNA ett effektivt sätt att dramatiskt öka sin cDNA avkastning. Denna förbättring utöver vad som kan uppnås med hjälp av tillgängliga metoder för att blanda mikroliter volymer (dvs skakningar, vortexa eller trituration). Även om det finns många omständigheter där mikrofluidik-baserade enheter som utför RT skulle vara ett stort framsteg, under andra omständigheter, inklusive vår egen, micromixing ensam ger betydande och tillräcklig nytta utan behov av ytterligare specialutrustning och-metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus Bioscience	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega Corp.	C1181
AMV-RT	Promega Corp.	M5101
dNTP set	Promega Corp.	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega Corp.	N2111
Nuclease-Free Water	Promega Corp.	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008