Aumentare le rese cDNA da singola cellula quantità di mRNA nelle reazioni standard di laboratorio della trascrittasi inversa utilizzando Microstreaming acustico

Summary

Descriviamo un nuovo metodo per aumentare la resa cDNA da singole cellule quantità di mRNA nelle reazioni inverso altrimenti standard di laboratorio trascrizione. La novità risiede nell'utilizzo di un micromixer, che utilizza il fenomeno della microstreaming acustico, di mescolare i fluidi a scale microlitro più efficacemente di agitazione, vortex o triturazione.

Abstract

L'espressione genica correlazione con il comportamento delle cellule è idealmente fatto a livello di singola cellula. Tuttavia, questo non è facilmente ottenibile, perché la piccola quantità di mRNA labili presenti in una singola cella (1-5% di 1-50pg RNA totale, o 0,01 2.5pg mRNA, per cella ¹⁾ degrada soprattutto prima di poter essere trascrizione inversa in una copia stabile cDNA. Ad esempio, utilizzando reagenti di laboratorio e hardware standard, solo un piccolo numero di geni possono essere qualitativamente valutati per cella ^2. Un modo per aumentare l'efficienza dello standard di laboratorio della trascrittasi inversa (RT) reazioni (reagenti standard, cioè in volumi microlitri) comprendente cella singola quantità di mRNA potrebbe essere quella di mescolare più rapidamente i reagenti in modo che il mRNA può essere convertito in cDNA prima che degrada. Tuttavia questo non è banale perché a scale microlitro flusso del liquido è laminare, cioè i metodi attualmente disponibili di miscelazione (es. agitazione, vortex e triturazione) non riescono a produrre sufficiente moto caotico di mescolare in modo efficace i reagenti. Per risolvere questo problema, le tecniche di miscelazione micro-scala devono essere utilizzati ^3,4. Un certo numero di tecnologie di miscelazione microfluidica a base sono state sviluppate con successo che aumentare le rese di reazione RT ^5-8. Tuttavia, le tecnologie microfluidica richiedono hardware specializzato che è relativamente costoso e non ancora ampiamente disponibili. Una soluzione più economica, più conveniente è auspicabile. L'obiettivo principale di questo studio è di dimostrare come l'applicazione di una nuova tecnica "micromixing" per standard di laboratorio reazioni RT composto da singole cellule quantità di mRNA aumenta significativamente il loro rendimento cDNA. Troviamo rendimenti cDNA aumentare di circa 10 100 volte, che consente: (1) maggior numero di geni da analizzare per cella, (2) un'analisi più quantitativa di espressione genica, e (3) rilevazione migliore di bassa abbondanza geni in singole cellule. Il micromixing si basa su acustica microstreaming ^9-12, un fenomeno in cui le onde sonore di propagazione intorno ad un piccolo ostacolo creare un flusso medio vicino l'ostacolo. Abbiamo sviluppato un acustico microstreaming dispositivo basato su ("micromixer") con una semplificazione chiave; microstreaming acustico può essere ottenuto a frequenze audio, garantendo che il sistema è un liquido-aria con un piccolo raggio di curvatura ^13. Il menisco di un volume microlitri di soluzione in un tubo fornisce un adeguato raggio di curvatura piccolo. L'uso delle frequenze audio significa che l'hardware può essere poco costoso e versatile ^13, e gli acidi nucleici e di altri reagenti biochimici non sono danneggiati come possono essere con sonicatori standard di laboratorio.

Protocol

1. Micromixing una reazione RT

1. Prima di eseguire una reazione RT con micromixing, equilibrare la micromixer alla temperatura desiderata della reazione RT.
   1. Posizionare il micromixer all'interno di un 37 ° C (o la temperatura consigliata dal fornitore RT) incubatore per almeno 1 ora prima dell'inizio della reazione RT.
2. Impostare il mix RT secondo il fornitore di trascrittasi inversa (ad esempio MMTV-RT da Promega, Omniscript da Qiagen) le istruzioni, tranne l'uso di singole cellule quantità di RNA totale di ingresso (per esempio 0.1-1pg/μl), invece del-ng mg quantità raccomandate dai fornitori.
   1. Noi uso standard sterile, priva di nucleasi 200μL tubi con pareti sottili PCR.
3. Posizione tubi RT saldamente il micromixer non appena sono pronti per la miscelazione. Il micromixer deve rimanere all'interno della 37 ° C incubatore per tutta la durata della reazione RT.
4. Selezionare la corretta frequenza e l'ampiezza di micromixing. In questo esempio si usa 150Hz.
5. Accendere il micromixer su e lasciarlo acceso per tutta la durata della reazione RT (60 minuti).
6. Accendere il micromixer fuori e prendere i tubi RT una volta la reazione di RT è completa.
7. Posizionare i tubi RT su ghiaccio e procedere come di consueto con ulteriori applicazioni quali quantitativa reazione a catena della polimerasi (qPCR o real-time PCR).

2. Rappresentante dei risultati:

Il vantaggio di micromixing nel contesto di reazioni RT è un aumento della resa del DNA rispetto a quando altri metodi di miscelazione (es. agitazione, vortex o triturazione) sono utilizzati. Questo può essere visto, per esempio, su successiva analisi del cDNA Reazione a catena della polimerasi utilizzando quantitativa (qPCR o real-time PCR). Figura 2A illustra gli effetti di micromixing per i primi 5 minuti (blu, "micromixed5") o l'intero 60 minuti (rosso, "micromixed60") rispetto a triturazione della reazione RT immediatamente prima della incubazione RT (nero, "triturazione" ). In questo caso il volume della reazione precedente RT era 25μL e conteneva 2.5pg di RNA totale. tracce qPCR utilizzando primers progettati per rilevare cDNA che rappresentano Nurr-1 mRNA sono indicati sopra, e la media ± SEM del numero di cicli per raggiungere fluorescenza massimo del 50% in 3 ripetizioni di questo stesso esperimento sono tracciate di seguito. L'asterisco indica una differenza statisticamente significativa (ANOVA a una via con Tukey confronti multipli). Si noti che micromixing per i primi 5 minuti della reazione precedente RT ha prodotto una non significativa miglioramento rispetto triturazione micromixing mentre per l'intero 60 minuti di reazione RT precedente ha prodotto un miglioramento significativo rispetto triturazione, la cui entità è stata pari a circa 15 qPCR cicli, in media.

Il vantaggio di micromixing può essere visto anche in curva di fusione analisi dei prodotti qPCR successive ottenuti. Nell'esperimento illustrato nella figura 2B, micromixing per l'intero 60 minuti di reazione precedente RT portato ad un segnale qPCR consistente in campioni di duplicato (Figura 2BA, 2 tracce di rosso), mentre micromixing per i primi 5 minuti o triturazione prodotto solo qPCR incoerente tracce (Figura 2BA, 2 tracce blu e 2 tracce nere, rispettivamente). Le tracce grigio sono controlli negativi ("neg.") In cui cDNA è stato lasciato fuori della reazione qPCR. Quando i prodotti qPCR da questo esperimento sono state denaturate dal rampa loro temperatura (analisi di fusione cioè curva) era evidente che determinati prodotti PCR (cioè un amplicone che era identica a quella ottenuta quando le concentrazioni molto più elevato di mRNA sono stati trascrizione inversa e amplificata da qPCR, dati non riportati) erano presenti solo le seguenti reazioni RT che erano stati micromixed per 60 minuti (Figura 2Bb, 2 tracce di rosso). Tutti gli altri (cioè micromixed5, triturazione e controlli negativi) di produzione di beni amplicone alternative (ad esempio dimeri primer).

Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo per l'applicazione di standard di laboratorio micromixing reazioni RT. Descrizioni più dettagliate del principio fisico coinvolto, la micromixer e come costruire un in-house micromixer sono forniti riferimenti ^13,14

Figura 2. Rappresentante dati qPCR illustrando i vantaggi della micromixing applicata al precedente reazioni RT composto da singole cellule quantità di mRNA in altro modo standard di laboratorio reazioni RT. Un esempio tracce qPCR rilevazione del DNA mRNA rappresenta la codifica Nurr-1 gene. Le reazioni precedente RT contenute 2.5pg di RNA totale in un volume di 25μL e sono stati eseguiti in un incubatore a 37 ° C per 60 minuti. Reazioni RT sono state remixate da triturazione del RT mix prima di incubazione (tracce nere, "triturazione"), micromixed durante i primi 5 minuti della reazione RT (tracce blu, "micromixed5") o micromixed per l'intero 60 minuti di reazione RT (tracce rosse, "micromixed60" ). Media ± SEM del numero di cicli necessari per raggiungere qPCR fluorescenza massimo del 50% sono riportati qui di seguito per n = 3 ripetizioni di questo esperimento. Asterisco indica una differenza significativa (ANOVA a una via con Tukey confronti multipli). B Un altro esperimento qPCR esaminando Nurr-1 prodotto cDNA, questa volta a seguito di reazioni RT contenente 25pg di RNA totale in un volume di 25μL. tracce qPCR (a), così come l'analisi della curva di fusione dei prodotti qPCR ottenuti (b) sono indicati per le diverse condizioni di miscelazione. Controlli negativi in ​​cui è stato inserito nessun cDNA nella reazione precedente RT sono inclusi anche (tracce grigie, "neg."). Reazioni RT con concentrazioni molto più elevate di mRNA sono stati eseguiti e prodotti picchi curva di fusione (dati non riportati) identici a quelli (b) per micromixed60 (tracce rosse) campioni.

Discussion

Il metodo di applicazione della micromixing a standard di laboratorio reazioni RT qui descritto può, ovviamente, coinvolgere mRNA raccolte attraverso qualsiasi mezzo (ad esempio la lisi cellulare, microdissezione laser cattura). Si può altresì comprendere qualsiasi marca o tipi di reagenti RT, qualsiasi temperatura (entro la tolleranza dei materiali della micromixer), e qualsiasi periodo di tempo. Per esempio, abbiamo osservato una migliore resa del DNA da reazioni di RT che comprende casuale esamero o oligo-dT primer. Potrebbe essere applicato anche alle altre trasformazioni biochimiche (ad esempio di ibridazione del DNA ¹⁵⁾ conforme alle seguenti vincoli. Il vincolo principale della tecnica attuale è la reazione deve avvenire all'interno di un piccolo (microlitri) goccia di soluzione, che forma una curva liquido-aria (ad esempio un menisco). Noi abitualmente utilizzano volumi di 10 o 25μL in 200μL tubi con pareti sottili PCR, producendo menischi con raggi di curvatura di 4,7 o 6,9 millimetri, rispettivamente. Questo è un requisito generale per un flusso di vortice da istituire nel menu, che allunga l'interfaccia tra diverse soluzioni e permette la diffusione da effettuare entro tempi più brevi. Questo vincolo si applica quindi a tutte le situazioni in cui micromixing potrebbero essere utilizzati. Infatti l'uso di piccoli volumi può essere un vantaggio, perché spesso la quantità di materiale in ingresso (es. RNA, DNA) è limitata, oltre a significativi risparmi possono essere fatte su altri reagenti. Nel contesto specifico di migliorare le rese di reazione RT, la reazione deve includere anche un numero limite di mRNA. Abbiamo dimostrato che micromixing standard di laboratorio reazioni RT composto da singole cellule quantità di input RNA aumenta la resa del DNA di circa 1-10 volte rispetto ai metodi standard di miscelazione (agitazione, vortex o triturazione), anche per i geni diversi da quelli illustrati Nurr-1 qui ^14. Abbiamo anche dimostrato che questo miglioramento diminuisce la concentrazione di ingresso dell'RNA aumenta ^14. Presumibilmente questo è dovuto a concentrazioni più elevate di RNA, l'aumentato tasso di diffusione, in assenza di micromixing assicura più mRNA viene convertito in cDNA prima che degrada.

Il metodo micromixing beneficeranno di alta fedeltà di trasmissione del segnale acustico attraverso il vaso di reazione alla soluzione di reazione. Abbiamo contribuito a raggiungere questo obiettivo la lavorazione accurata dei fori nella piastra di miscelazione acrilico sovrastante diffusori (Figura 1) in modo tale che fossero conica per adattarsi precisamente la 200μL tubi con pareti sottili PCR utilizzato. Questo massimizzare il contatto tra i tubi e la piastra in acrilico e trasmissione quindi massimizzato del segnale acustico. Uno deve anche assicurare che le provette di reazione siano ben tenuti all'interno dei fori di miscelazione perché possono venire fuori durante la miscelazione a causa delle vibrazioni meccaniche.

La nostra definizione di microstreaming acustico è forse più ampio di alcune definizioni fenomenologicamente-based. Tuttavia, c'è una buona recensione di Riley ¹⁶ che classifica questi flussi fondamentalmente, piuttosto che fenomenologicamente. Il termine non lineare di equazioni di Navier-Stokes deve essere abbastanza grande in modo che al secondo ordine vi è un flusso medio. Dal momento che questo termine è più volte la velocità di un gradiente di velocità, tutto quello che facciamo per rendere la scala di lunghezza su cui la velocità varia sufficientemente piccolo (cioè rendere il gradiente di velocità sufficientemente grande) può dare origine a un flusso microstreaming. Il nostro acustico microstreaming dispositivo basato su ("micromixer") consente microstreaming acustico al audio (cioè a bassa potenza) frequenze, assicurando che il sistema è un liquido-aria con un piccolo raggio di curvatura ^13. Al contrario, "acustico streaming" è spesso definita con un termine non lineare che è fatta di grandi dimensioni con una velocità di grandi dimensioni (cioè ad alta potenza). Nel nostro caso, una piccola goccia in un pozzo è fatto per oscillare, la tensione superficiale della goccia, insieme con la sua viscosità, può giocare un ruolo nella creazione di un flusso medio utile per la miscelazione ^13. Gli esperimenti hanno inoltre dimostrato che le grandi (10-100μm), le particelle possono essere spostati all'interno di grandi gocce di vibrazione che usiamo, ma questo è probabilmente da un meccanismo diverso specifico per le particelle ^17.

In conclusione, l'applicazione di standard di laboratorio per micromixing reazioni RT composto da singole cellule quantità di RNA è un modo efficace per aumentare notevolmente la resa del DNA. Questo miglioramento è al di là di quello che può essere raggiunto utilizzando metodi attualmente disponibili dei volumi microlitri di miscelazione (es. agitazione, vortex o triturazione). Anche se ci sono molte circostanze nelle quali microfluidica dispositivi basati su prestazioni TI sarebbe un grande progresso, in altre circostanze, compreso il nostro, micromixing da solo fornisce vantaggi significativi e adeguata senza la necessità di ulteriori attrezzature specializzate e metodi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus Bioscience	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega Corp.	C1181
AMV-RT	Promega Corp.	M5101
dNTP set	Promega Corp.	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega Corp.	N2111
Nuclease-Free Water	Promega Corp.	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008