Summary
אנו מתארים שיטה חדשה להגדלת התשואה cDNA של תא בודד של mRNA בכמויות ברמת אחרת הפוכה התגובות מעבדה שעתוק. החידוש מתגורר השימוש micromixer, אשר מנצל את התופעה של microstreaming אקוסטי, לערבב נוזלים בקני מידה microliter בצורה יעילה יותר מאשר רועד, vortexing או טחינה דקה.
Abstract
ביטוי גנים correlating עם התנהגות התא נעשית באופן אידיאלי ברמת מתחיל מתא בודד. עם זאת, זו אינה מושגת בקלות כי כמות קטנה של mRNA יציב נוכח בתא בודד (1-5% של 1-RNA 50pg הכולל, או 0.01-mRNA 2.5pg, לכל תא 1) בעיקר מדרדרת לפני שניתן יהיה להפוך עיבד לתוך עותק cDNA יציב. לדוגמה, באמצעות ריאגנטים מעבדה סטנדרטיים החומרה, רק מספר קטן של גנים ניתן להעריך איכותית לכל תא 2. דרך אחת להגביר את היעילות של תקן מעבדה הפוכה transcriptase (RT) תגובות (ריאגנטים כלומר תקן בכמויות microliter) הכולל תא בודד כמויות של mRNA יהיה במהירות רבה יותר בתמהיל ריאגנטים כך את ה-mRNA ניתן להמיר cDNA לפני שהיא מדרדרת. אולם זה לא טריוויאלי כי בקני מידה microliter זרימת הנוזל היא למינרית, כלומר השיטות הקיימות כיום של ערבוב (כלומר רועד, vortexing ו טחינה דקה) לא מצליחים לייצר תנועה כאוטית מספיק ביעילות לערבב חומרים כימיים. כדי לפתור בעיה זו, מיקרו בקנה מידה טכניקות ערבוב צריך לשמש 3,4. מספר microfluidic טכנולוגיות מבוססות ערבוב אשר פותחו בהצלחה להגדיל את התשואות RT תגובה 5-8. עם זאת, טכנולוגיות מיקרופלואידיקה דורשים חומרה מיוחדת, כי הוא יקר יחסית, עדיין אינו זמין באופן נרחב. פתרון זול יותר, נוח יותר רצוי. המטרה העיקרית של מחקר זה היא להדגים כיצד היישום של טכניקה חדשנית "micromixing" לתגובות מעבדה סטנדרטיים RT הכוללת תא בודד כמויות של mRNA מגביר באופן משמעותי בתשואות cDNA שלהם. אנו מוצאים תשואות cDNA להגדיל בכ 1-10 כפולה, המאפשרת: (1) במספרים גדולים יותר של גנים כדי להיות מנותח לכל תא, (2) ניתוח כמותי יותר של ביטוי גנים; ו (3) זיהוי טוב יותר נמוכה שפע גנים בתוך תאים בודדים. Micromixing מבוססת על אקוסטית microstreaming 9-12, תופעה שבה גלי הקול מתפשט סביב מכשול קטן ליצור זרימה מתכוון ליד המכשול. פיתחנו מכשיר אקוסטי microstreaming מבוססות ("micromixer"), עם פישוט מפתח: microstreaming אקוסטי ניתן להשיג בתדרים אודיו ידי הבטחת למערכת יש ממשק נוזלי אוויר עם רדיוס עקמומיות קטן של 13. המניסקוס של נפח microliter של פתרון צינור מספק רדיוס קטן כראוי של עקמומיות. השימוש בתדרי שמע כלומר החומרה יכול להיות זולה צדדי 13, וחומצות גרעין ו ריאגנטים ביוכימיים אחרים אינם פגומים כמו שהם יכולים להיות עם sonicators מעבדה סטנדרטיים.
Protocol
1. Micromixing תגובה RT
- לפני ביצוע תגובה RT עם micromixing, לאזן micromixer לטמפרטורה הרצויה התגובה RT.
- מניחים את micromixer בתוך 37 ° C (או הטמפרטורה המומלצת על ידי הספק RT) חממה לפחות שעה 1 לפני תחילת התגובה RT.
- הגדרת תמהיל RT לפי הספק של transcriptase הפוכה (למשל MMTV-RT מ Promega, Omniscript מ Qiagen) הוראות, למעט תא בודד כמויות להשתמש בסך הכל קלט RNA (למשל 0.1-1pg/μl), במקום מיקרוגרם ng- כמויות המומלץ על ידי הספקים.
- אנו משתמשים תקן סטרילי, nuclease ללא 200μL דק דופן צינורות PCR.
- מיקום RT צינורות היטב לתוך micromixer ברגע שהם מוכנים ערבוב. Micromixer צריך להישאר בתוך 37 ° C החממה למשך התגובה RT.
- בחר את התדירות המתאימה משרעת של micromixing. בדוגמה זו אנו משתמשים 150Hz.
- כבה את micromixer על ולהשאיר אותה במשך כל תקופת התגובה RT (60 דקות).
- כבה את micromixer את לקחת את שפופרות RT החוצה פעם את התגובה RT תושלם.
- מניחים את צינורות RT על הקרח ולהמשיך כרגיל עם יישומים נוספים, כגון תגובת שרשרת כמותי פולימראז (qPCR או בזמן אמת PCR).
2. נציג תוצאות:
היתרון של micromixing בהקשר של תגובות RT היא עלייה בתשואה cDNA יחסית כאשר שיטות ערבוב אחרים (כגון טלטולים, vortexing או טחינה דקה) משמשים. ניתן לראות זאת, למשל, על ניתוח בדיעבד של התגובה cDNA באמצעות כמותי פולימראז שרשרת (qPCR או בזמן אמת PCR). איור 2A ממחיש את ההשפעות של micromixing במשך 5 הדקות הראשונות (כחול, "micromixed5") או כל 60 דקות (אדום, "micromixed60") לעומת טחינה דקה התגובה RT מיד לפני הדגירה RT (שחור, "טחינה דקה" ). במקרה זה את עוצמת התגובה RT הקודמת היה 25μL והוא הכיל 2.5pg של רנ"א מוחלט. עקבות qPCR באמצעות primers נועד לזהות Nurr-1 cDNA המייצג mRNA מוצגים לעיל, וכן אמצעי ± SEMs של מספר מחזורים כדי להגיע הקרינה המקסימלית של 50% 3 חזרות של הניסוי הזה הם זממו אותו למטה. הכוכבית מציינת הבדל משמעותי סטטיסטית (ANOVA חד כיווני עם השוואות טיוקי מרובים). שים לב micromixing במשך 5 הדקות הראשונות של התגובה הקודמת RT המיוצר שיפור לא משמעותי על פני טחינה דקה ואילו micromixing במשך 60 דקות שלמות של התגובה הקודמת RT המיוצר שיפור משמעותי לעומת טחינה דקה, גודל שהיה שווה ערך ל כ 15 qPCR מחזורי, בממוצע.
היתרון של micromixing ניתן גם לראות ניתוח עקומת התכה של המוצרים הבאים המתקבלים qPCR. במהלך הניסוי ממחישה 2B איור, micromixing במשך 60 דקות שלמות של התגובה RT הקודמת הביאו אות qPCR עקבית כפולות דגימות (איור 2BA, 2 עקבות אדום), ואילו micromixing במשך 5 הדקות הראשונות או טחינה דקה מיוצר רק qPCR עקבי עקבות (איור 2BA, 2 עקבות כחול 2 עקבות שחור, בהתאמה). עקבות אפור פיקוח שליליים ("נג"). CDNA שבו הושאר מחוץ התגובה qPCR. כאשר המוצרים qPCR מניסוי זה היו מפוגל ידי ramping הטמפרטורה שלהם (כלומר ניתוח עקומת התכה) היה ברור כי ראוי PCR המוצרים (כלומר amplicon היה זהה לזה שהושג כאשר ריכוזים גבוהים בהרבה של mRNA תועתקו הפוך מוגבר על ידי qPCR, מידע לא מוצג) נכחו רק התגובות הבאות RT שהיו micromixed במשך 60 דקות (איור 2Bb, 2 עקבות אדומים). כל האחרים (כלומר micromixed5, טחינה דקה בקרות שלילי) שנוצר amplicon מוצרים אלטרנטיביים (למשל הדימרים פריימר).
באיור 1. תרשים זרימה של פרוטוקול ליישום micromixing לרמת התגובות מעבדה RT. תיאורים מפורטים יותר של עקרון פיזית המעורבים, micromixer וכיצד לבנות בתוך הבית micromixer ניתנים הפניות 13,14
איור 2. נציג נתונים qPCR הממחישות את היתרונות של micromixing להחיל הקודמת התגובות RT הכוללת תא בודד כמויות של mRNA בתגובות מעבדה סטנדרטיים אחרת RT. דוגמה עקבות qPCR גילוי mRNA המייצג cDNA קידוד Nurr-1 הגן. התגובות הקודמות RT הכלול 2.5pg של רנ"א הכולל בהיקף של 25μL ו בוצעו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. התגובות היו מעורבות RT ידי טחינה דקה של RT לערבב לפני הדגירה (עקבות שחורים, "טחינה דקה"), micromixed במהלך 5 הדקות הראשונות של התגובה RT (עקבות כחול, "micromixed5") או micromixed במשך 60 דקות שלמות של התגובה RT (עקבות אדומים, "micromixed60" ). אמצעי ± SEMs של מספר מחזורים qPCR נדרש להגיע הקרינה המקסימלית 50% הם זממו להלן עבור n = 3 חזרות של הניסוי הזה. כוכבית מציינת הבדל משמעותי (ANOVA חד כיווני עם השוואות טיוקי מרובים). B ניסוי נוסף qPCR בחינת Nurr-1 מוצר cDNA, הפעם בעקבות התגובות RT המכיל 25pg של רנ"א הכולל בהיקף של 25μL. עקבות qPCR (א), כמו גם ניתוח עקומת התכה של המוצרים qPCR שהושגו (ב) מוצגים על תנאי ערבוב שונים. שולטת שלילי שבו לא cDNA נכלל התגובה RT הקודמת כלולים גם (עקבות אפור, "נג").. התגובות RT עם ריכוזים גבוהים בהרבה של mRNA בוצעו גם והפיק עקומת התכה פסגות (מידע לא מוצג) זהים לאלה (ב) עבור micromixed60 (עקבות אדומים) דגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת היישום של micromixing לרמת התגובות מעבדה RT המתואר כאן יכול, כמובן, כרוך mRNA שנקטפו באמצעות שיטה כלשהי (למשל תמוגה התא, לייזר microdissection ללכוד). זה גם יכול לכלול כל המותגים או סוגי RT ריאגנטים, כל טמפרטורה (תוך סובלנות של החומרים של micromixer), וכל תקופה. לדוגמה, ראינו שיפור התשואות cDNA מתגובות RT הכוללת hexamer אקראי או אוליגו DT-primers. זה יכול להיות מיושם גם על התמורות ביוכימיים אחרים (כגון דנ"א הכלאה 15) העומדות על האילוצים הבאים. האילוץ העיקרי של השיטה הנוכחית היא התגובה חייב להתרחש בתוך טיפה (microliter) קטן של פתרון זה מהווה ממשק מעוקל נוזל האוויר (למשל במניסקוס). אנו משתמשים באופן שגרתי כרכים של 10 או ב 25μL דק דופן צינורות 200μL PCR, הפקת menisci עם רדיוס עקמומיות של 4.7 או 6.9mm, בהתאמה. זוהי דרישה כללית זרימת מערבולת שיוקם בטיפה, אשר מתארך את הממשק בין פתרונות שונים ומאפשר דיפוזיה להתקיים על לוחות הזמנים קצר. אילוץ זה ולכן חל על כל המצבים שבהם micromixing עשוי לשמש. ואכן השימוש בנפחים קטנים יכול להיות יתרון, כי בדרך כלל את כמות החומר קלט (למשל RNA, DNA) היא מוגבלת, וכן חיסכון משמעותי יכול להתבצע על חומרים כימיים אחרים. בהקשר הספציפי של שיפור התשואות RT התגובה, התגובה חייבת לכלול גם הגבלת כמות של mRNA. הראינו כי micromixing תקן מעבדה התגובות RT הכוללת תא בודד סכומי קלט RNA מגדיל תשואה cDNA שלהם בכ 1-10 על פי שיטות סטנדרטיות של ערבוב (רעד, vortexing או טחינה דקה), כולל גנים אחרים מאשר Nurr-1 מאויר כאן 14. הראינו גם שיפור זה מפחית את הריכוז של קלט RNA מגדיל 14. סביר להניח שזה בגלל ריכוזים גבוהים יותר ב-RNA, שיעור מוגבר של דיפוזיה בהעדר micromixing מבטיח mRNA יותר מומר cDNA לפני מדרדרת.
השיטה micromixing יהנה שידור באיכות גבוהה של האות האקוסטי באמצעות כלי התגובה לפתרון התגובה. עזרנו להשיג זאת על ידי עיבוד קפדני של החורים ערבוב בצלחת אקריליק המכסה את הרמקולים (איור 1) כאלה שהם היו מחודדות כדי שיתאים בדיוק 200μL דק דופן צינורות PCR בשימוש. זה מוגדל הקשר בין צינורות צלחת אקריליק שידור מוגדל ולכן האות האקוסטי. צריך גם להבטיח כי צינורות התגובה מוחזקים בבטחה תוך ערבוב את החורים כי הם יכולים לצאת במהלך ערבוב כתוצאה של תנודות מכניות.
ההגדרה שלנו microstreaming אקוסטית היא אולי רחבה יותר מאשר כמה הגדרות פנומנולוגית מבוססות. עם זאת, יש ביקורת טובה על ידי ריילי 16 המסווגת זרמים אלה מיסודה, ולא פנומנולוגית. המונח ליניארית במשוואה Navier סטוקס צריך להיות גדול מספיק, כך על הצו השני יש זרימה מתכוון. מאז מונח פעמים מהירות שיפוע מהירות, כל דבר שאנחנו עושים על מנת להפוך את סולם אורך מעל המהירות שבה משתנה קטן מספיק (כלומר, להפוך את מהירות שיפוע גדול מספיק) יכול להצמיח זרימה microstreaming. Microstreaming מבוססי התקן אקוסטי שלנו ("micromixer") מאפשר microstreaming אקוסטית ב (צריכת חשמל נמוכה, כלומר) תדרי השמע על ידי הבטחת למערכת יש ממשק נוזלי אוויר עם רדיוס עקמומיות קטן של 13. לעומת זאת, "אקוסטי הזרמת" מוגדר לעתים קרובות על ידי טווח קוי כי הוא עשה גדולות על ידי מהירות גדול (כלומר כוח גבוה). במקרה שלנו, טיפה קטן גם הוא עשוי להתנדנד, מתח הפנים של הטיפה, יחד עם צמיגות שלה, עשויים לשחק תפקיד ביצירת תזרים מתכוון שימושי ערבוב 13. ניסויים הראו כי גם גדול (10-100μm) חלקיקים ניתן להעביר בתוך טיפות רוטט גדול יותר מאשר אנו משתמשים, אולם זה כנראה על ידי מנגנון שונה ספציפיים חלקיקים 17.
לסיכום, יישום של micromixing לרמת התגובות מעבדה RT הכוללת תא בודד כמויות של רנ"א היא דרך יעילה כדי להגדיל באופן משמעותי את התשואה cDNA שלהם. שיפור זה מעל ומעבר למה שניתן להשיג בשיטות הקיימות כיום כרכים microliter ערבוב (כלומר רועד, vortexing או טחינה דקה). אמנם יש נסיבות רבות שבהן מיקרופלואידיקה מכשירים מבוססי ביצוע RT תהיה התקדמות גדולה, בנסיבות אחרות, כולל שלנו, micromixing לבד מספקת יתרון משמעותי והולם ללא צורך בציוד מיוחד ושיטות נוספות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (הפרויקט להעניק אין. 6288480) ואת סקובי וקלייר מקינון אמון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus Bioscience | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega Corp. | C1181 | |
| AMV-RT | Promega Corp. | M5101 | |
| dNTP set | Promega Corp. | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega Corp. | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
References
- Livesey, F. J.
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N.
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
