Het verhogen van cDNA Opbrengsten van Single-cell hoeveelheden mRNA in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers Reacties met behulp van Acoustic Microstreaming

Summary

Beschrijven we een nieuwe methode voor het verhogen van cDNA opbrengst van eencellige hoeveelheden mRNA in andere standaard laboratorium reverse transcriptie reacties. De nieuwigheid schuilt in het gebruik van een micromixer, die het fenomeen van akoestische microstreaming gebruikt om vloeistoffen mix op microliter schaal effectiever dan schudden, vortexen of fijnwrijving.

Abstract

Correleren genexpressie met cel gedrag is ideaal gedaan op de single-cell niveau. Dit is echter niet gemakkelijk te bereiken, omdat de kleine hoeveelheid labiele mRNA aanwezig is in een enkele cel (1-5% van de 1-50pg totaal RNA, of 0,01-2.5pg mRNA, per cel ¹⁾ meestal degradeert voordat het kan worden omgekeerd getranscribeerd in een stabiele cDNA kopie. Bijvoorbeeld met behulp van standaard laboratorium-reagentia en hardware, kan slechts een klein aantal genen kwalitatief worden beoordeeld per cel ^2. Een manier om de efficiëntie van standaard laboratorium reverse transcriptase (RT) reacties (dwz standaardtenders reagentia in microliter volumes), bestaande uit eencellige hoeveelheden mRNA te verhogen zou zijn om sneller meng de reagentia, zodat het mRNA kan worden omgezet naar cDNA voordat het breekt. Dit is echter niet triviaal omdat op microliter vloeistof schalen stroming laminair, dat wil zeggen op dit moment beschikbare methoden het mengen (dat wil zeggen schudden, vortexen en tritureren) onvoldoende chaotische beweging om effectief te mengen reagentia te produceren. Om dit probleem oplossen, micro-schaal mengen technieken worden gebruikt ^3,4. Een aantal van microfluïdische-based mixing technologieën zijn ontwikkeld die met succes te verhogen RT-reactie opbrengst ^5-8. Echter, microfluidics technologieën vereisen gespecialiseerde hardware die is relatief duur en nog niet algemeen beschikbaar. Een goedkoper, handiger oplossing is wenselijk. Het belangrijkste doel van deze studie is om aan te tonen hoe de toepassing van een roman "micromixing"-techniek met standaard laboratorium RT reacties bestaande uit eencellige hoeveelheden mRNA aanzienlijk hun cDNA opbrengst toeneemt. We vinden cDNA opbrengst te verhogen met ongeveer 10-100-voudig, die het mogelijk maakt: (1) een groter aantal genen te analyseren per cel, (2) meer kwantitatieve analyse van genexpressie, en (3) een betere detectie van lage-overvloed genen in enkele cellen. De micromixing is gebaseerd op akoestische microstreaming ^9-12, een fenomeen waarbij geluidsgolven verspreiden rond een klein obstakel maakt een gemiddelde stroming in de buurt van de hindernis. Hebben wij een akoestisch microstreaming-apparaat ("micromixer") met een belangrijke vereenvoudiging, akoestische microstreaming kan worden bereikt op audio-frequenties door te zorgen voor het systeem heeft een vloeistof-lucht-interface met een kleine kromtestraal ^13. De meniscus van een microliter volume van de oplossing in een buis biedt een voldoende kleine kromtestraal. Het gebruik van audio-frequenties betekent dat de hardware kan goedkoop en veelzijdig ^13, en nucleïnezuren en andere biochemische reagentia worden niet beschadigd als ze kunnen worden met standaard laboratorium sonicators.

Protocol

1. Micromixing een RT reactie

1. Voordat u een RT-reactie met micromixing, evenwicht de micromixer op de gewenste temperatuur van de RT-reactie.
   1. Plaats de micromixer in een 37 ° C (of de temperatuur wordt aanbevolen door de leverancier RT) incubator gedurende tenminste 1 uur voor het begin van de RT-reactie.
2. Stel de RT mix op basis van de reverse transcriptase leverancier (bijv. MMTV-RT van Promega, Omniscript van Qiagen) instructies, behalve gebruik maken van single-cell hoeveelheden van de input totaal RNA (bijv. 0.1-1pg/μl), in plaats van de ng-ng hoeveelheden aanbevolen door leveranciers.
   1. We maken gebruik van standaard steriele, nuclease-vrij 200μL dunwandige PCR-buizen.
3. Positie RT buizen stevig in het micromixer zodra ze klaar zijn voor het mengen. De micromixer moet blijven in de 37 ° C incubator voor de duur van de RT-reactie.
4. Selecteer de juiste frequentie en amplitude van micromixing. In dit voorbeeld gebruiken we 150 Hz.
5. Schakel de micromixer op en laat het op voor de gehele duur van de RT-reactie (60 minuten).
6. Schakel de micromixer uit en neem de RT buizen eenmaal de RT-reactie is voltooid.
7. Plaats de RT buizen op ijs en ga verder zoals normaal met andere toepassingen, zoals kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR of real-time PCR).

2. Representatieve resultaten:

Het voordeel van micromixing in het kader van RT reacties is een toename van de cDNA opbrengst ten opzichte van wanneer andere het mengen van methoden (bijv. schudden, vortexen of tritureren) worden gebruikt. Dit kan worden gezien, bijvoorbeeld, bij de daaropvolgende analyse van het cDNA met behulp van kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR of real-time PCR). Figuur 2A illustreert de effecten van micromixing voor de eerste 5 minuten (blauw, "micromixed5") of de volledige 60 minuten (rood, "micromixed60") vergeleken met fijnwrijving van de RT-reactie onmiddellijk voorafgaand aan de RT incubatie (zwart, "tritureren" ). In dit geval is het volume van het voorgaande RT-reactie was 25μL en bevatte 2.5pg totaal RNA. qPCR sporen met behulp van primers ontworpen om cDNA die Nurr-1 mRNA te detecteren zijn hierboven weergegeven, en de middelen ± SEM van het aantal cycli tot maximaal 50% fluorescentie te bereiken in drie herhalingen van hetzelfde experiment worden hieronder weergegeven. Het sterretje duidt op een statistisch significant verschil (one-way ANOVA met Tukey meerdere vergelijkingen). Merk op dat micromixing voor de eerste 5 minuten van de voorgaande RT-reactie een niet-significante verbetering ten opzichte van tritureren geproduceerd terwijl micromixing voor de gehele 60 minuten van de voorgaande RT-reactie een significante verbetering ten opzichte van fijnwrijving, waarvan de omvang komt overeen met ongeveer 15 qPCR cycli, gemiddeld.

Het voordeel van micromixing kan ook worden gezien in smeltcurve analyse van de latere verkregen qPCR producten. In het experiment in figuur 2B, micromixing voor de gehele 60 minuten van de voorgaande RT reactie resulteerde in een consistente qPCR signaal in tweevoud monsters (figuur 2Ba, 2 rode sporen), terwijl micromixing voor de eerste 5 minuten of tritureren alleen geproduceerd inconsistent qPCR sporen (figuur 2Ba, 2 blauwe sporen en 2 zwarte sporen, respectievelijk). De grijze sporen zijn negatieve controles ("neg.") Waarin cDNA werd uit links van de qPCR reactie. Wanneer de qPCR producten van dit experiment werden gedenatureerd door speedramp hun temperatuur (dat wil zeggen smeltcurve analyse) was het duidelijk dat de geschikte PCR-producten (dat wil zeggen een amplicon die identiek was aan die verkregen wanneer veel hogere concentraties van mRNA werden reverse getranscribeerd en versterkt door qPCR, gegevens niet getoond) aanwezig waren alleen na RT reacties die waren micromixed gedurende 60 minuten (figuur 2BB, 2 rode sporen). Alle anderen (dat wil zeggen micromixed5, trituratie en negatieve controles) gegenereerd alternatief amplicon producten (bijv. primer dimeren).

Figuur 1. Stroomdiagram van het protocol voor het toepassen van micromixing aan standaard laboratorium RT reacties. Meer gedetailleerde beschrijvingen van de natuurkundige principe gaat, de micromixer en hoe u een in-house micromixer bouwen zijn voorzien in de referenties ^13,14

Figuur 2. Vertegenwoordiger qPCR gegevens illustreren de voordelen van micromixing toegepast op voorgaande RT reacties bestaande uit eencellige hoeveelheden mRNA in andere standaard laboratorium RT reacties. A Voorbeeld qPCR sporen detecteren van cDNA die mRNA dat codeert voor het Nurr-1 gen. De voorgaande RT reacties die 2.5pg totaal RNA in een volume van 25μL en werden uitgevoerd in een incubator bij 37 ° C gedurende 60 minuten. RT reacties waren gemengd door trituratie van de RT mix voorafgaand aan de incubatie (zwart sporen, "tritureren"), micromixed tijdens de eerste 5 minuten van de RT-reactie (blauwe sporen, "micromixed5") of micromixed voor de volledige 60 minuten van de RT-reactie (rood sporen, "micromixed60" ). Gemiddelden ± SEM van het aantal qPCR cycli nodig is om maximaal 50% fluorescentie te bereiken zijn hieronder weergegeven voor n = 3 herhalingen van dit experiment. Asterisk geeft een significant verschil (one-way ANOVA met Tukey meerdere vergelijkingen). B Een andere qPCR experiment te onderzoeken Nurr-1 cDNA product, dit keer na RT reacties met 25pg totaal RNA in een volume van 25μL. qPCR sporen (een) als smeltcurve analyse van de verkregen qPCR producten (b) worden weergegeven voor de verschillende mengomstandigheden. Negatieve controles waarin geen cDNA werd opgenomen in de vorige RT-reactie zijn ook opgenomen (grijs sporen, "neg."). RT reacties met veel hogere concentraties van mRNA werden ook uitgevoerd en geproduceerd smeltcurve pieken (gegevens niet getoond) identiek aan die in (b) voor de micromixed60 (rood sporen) monsters.

Discussion

De wijze van toepassing van micromixing van standaard laboratorium RT reacties hier beschreven kan natuurlijk, betrekken mRNA geoogst via een methode (bijvoorbeeld cellysis, laser capture microdissectie). Het kan ook omvatten alle merken of types van RT reagentia, bij elke temperatuur (binnen de tolerantie van de materialen van de micromixer), en een periode van tijd. Zo hebben we vast beter cDNA opbrengsten van RT reacties bestaande uit willekeurig hexameer of oligo-dT primers. Het kan ook worden toegepast op andere biochemische transformaties (bijvoorbeeld DNA hybridisatie ¹⁵⁾ voldoen aan de volgende beperkingen. De belangrijkste beperking van de huidige techniek is de reactie dient te geschieden binnen een kleine (microliter) druppel van de oplossing die een gebogen vloeistof-lucht-interface (bijvoorbeeld een meniscus) vormen. We routinematig gebruik van volumes van 10 of 25μL in 200μL dunwandige PCR-buisjes, het produceren van menisci met een afrondingsstraal van 4,7 of 6,9 mm, respectievelijk. Dit is een algemene verplichting tot een vortex stroom op te richten in de druppel, die de interface tussen de verschillende oplossingen verlengt en laat diffusie plaats te vinden op de kortere tijdschalen. Deze beperking geldt dus voor alle situaties waarin micromixing kunnen worden gebruikt. Inderdaad het gebruik van kleine hoeveelheden kan een voordeel zijn, omdat vaak de hoeveelheid van het uitgangsmateriaal (bijv. RNA, DNA) is beperkt, plus aanzienlijke besparingen kunnen worden gemaakt op andere reagentia. In de specifieke context van het verbeteren van RT-reactie oplevert, moet de reactie omvatten ook een beperkende hoeveelheid van mRNA. We hebben laten zien dat micromixing standaard laboratorium RT reacties bestaande uit eencellige hoeveelheden van de input RNA hun cDNA rendement stijgt met ongeveer 10-100-vouw over standaard methoden het mengen (schudden, vortexen of tritureren), ook voor andere genen dan Nurr-1 geïllustreerde hier ^14. We hebben ook aangetoond dat deze verbetering neemt af naarmate de concentratie van de input-RNA toe ^14. Vermoedelijk komt dit doordat bij hogere concentraties RNA, het verhoogde tarief van diffusie in de afwezigheid van micromixing zorgt voor meer mRNA wordt omgezet in cDNA voordat het breekt.

De micromixing methode zal profiteren van de high-fidelity transmissie van het akoestische signaal door het reactievat om de reactie-oplossing. We hielpen dit te bereiken door een zorgvuldige bewerking van het mengen gaten in de acryl plaat bovenliggende de luidsprekers (Figuur 1) zodanig dat ze spits om precies te passen in de 200μL dunwandige gebruikte PCR-buizen. Dit gemaximaliseerd het contact tussen de buizen en de acryl plaat en dus gemaximaliseerd overdracht van het akoestisch signaal. Men moet ook zorgen dat de reageerbuisjes goed zijn gehouden binnen het mengen gaten want ze kunnen komen tijdens het mengen als gevolg van de mechanische trillingen.

Onze definitie van akoestische microstreaming is wellicht ruimer dan sommige fenomenologisch-op basis van definities. Echter, er is een goede toetsing door Riley ¹⁶ dat deze stromen classificeert fundamenteel, in plaats van fenomenologisch. De niet-lineaire term in de Navier-Stokes vergelijking moet groot genoeg zijn, zodat in tweede orde is er een gemiddelde flow. Sinds die term is een snelheid maal een snelheidsgradiënt, alles wat we doen om de lengte schaal waarover de snelheid varieert voldoende klein zijn (dat wil zeggen maken de snelheidsgradiënt voldoende grote) te maken kan aanleiding geven tot een microstreaming stromen. Onze akoestische microstreaming-apparaat ("micromixer") kan akoestisch microstreaming op audio (dat wil zeggen laag vermogen) frequenties door te zorgen voor het systeem heeft een vloeistof-lucht-interface met een kleine kromtestraal ^13. In tegenstelling, "akoestische streaming" wordt vaak bepaald door een niet-lineaire term die is groot gemaakt door een grote snelheid (dat wil zeggen hoog vermogen). In ons geval is een kleine daling in een goed gemaakt te oscilleren, de oppervlaktespanning van de druppel, samen met de viscositeit, kan een rol spelen in het creëren van een gemiddeld debiet nuttig voor het mengen van ^13. Experimenten hebben ook aangetoond dat grote (10-100 urn) deeltjes kan worden verplaatst binnen grotere vibrerende druppels dan we gebruiken, maar dit is waarschijnlijk door een ander mechanisme specifiek deeltjes ^17.

Kortom, de toepassing van micromixing aan standaard laboratorium RT reacties bestaande uit eencellige hoeveelheden RNA is een effectieve manier om drastisch te verhogen van hun rendement cDNA. Deze verbetering is dan wat bereikt kan worden met de thans beschikbare methoden voor het mengen microliter volumes (dat wil zeggen schudden, vortexen of fijnwrijving). Hoewel er veel omstandigheden waarin de microfluidics-gebaseerde apparaten uitvoeren van RT zou een grote vooruitgang zijn, in andere omstandigheden, waaronder onze eigen, micromixing alleen biedt aanzienlijke en voldoende profiteren zonder de noodzaak van verdere gespecialiseerde apparatuur en methoden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus Bioscience	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega Corp.	C1181
AMV-RT	Promega Corp.	M5101
dNTP set	Promega Corp.	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega Corp.	N2111
Nuclease-Free Water	Promega Corp.	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008