Summary
我々は、そうでなければ標準的な実験の逆転写反応でmRNAの単一セルの量からcDNA収量を増加させるための新しい方法を説明します。目新しさは、ボルテックスまたは粉砕、揺れよりも効果的にマイクロリットルスケールでの流体を混合するために、音響microstreamingの現象を利用したマイクロミキサーの使用に存在する。
Abstract
細胞の挙動との相関遺伝子発現は、理想的には単一細胞レベルで行われます。それが転写を逆にすることができます前に、単セル（1-5 1 - 50pgのトータルRNAの％、または0.01 - 2.5pg mRNAは、セル1あたり）に存在する不安定なmRNAの少量がほとんど劣化するため、これは容易に達成されていません安定したcDNAコピーに。例えば、標準的な実験用試薬とハードウェアを使用して、遺伝子のわずかな数は、定性的にセル2ごとに評価することができます。 mRNAの単セルの量を構成する標準的な実験の逆転写酵素（RT）反応（マイクロリットルの量で、すなわち標準試薬）の効率を向上させる一つの方法は、それが低下する前にmRNAをcDNAに変換できるので、より迅速に試薬を混合することです。しかし、マイクロリットルスケールでの液体の流れが層流であるため、これは自明ではない、すなわち混合の現在利用可能なメソッド（、揺れボルテックスと粉砕つまりは）効果的に試薬を混合するために十分なカオス運動を生成するために失敗する。この問題を解決するために、マイクロスケールの混合技術は、3,4を使用する必要があります。マイクロ流体ベースのミキシング技術の数が正常にRT反応の収量5-8を増加させるが開発されている。しかし、マイクロ流体技術は、比較的高価であり、まだ広く利用できない特殊なハードウェアを必要とする。安く、より便利なソリューションが望まれる。本研究の主な目的は、mRNAの単セルの量を構成する標準的な実験RT反応の小説"マイクロミキシング"技術の応用が著しく、そのcDNA収量を増加させる方法を説明することです。遺伝子発現の解析（2）より多くの定量;（1）セルごとに分析される遺伝子の大きい数と発現量の低い遺伝子の（3）良好な検出：我々は、cDNAの収量が可能な約10 100倍、増加見つける単一細胞インチマイクロミキシングは音響は、9-12小障害物の周りに伝播する音波が障害物の近くに平均流を作る現象をmicrostreamingに基づいています。我々は、主要な簡素化と音響microstreamingベースのデバイスを（"マイクロミキサー"）を開発しました。音響microstreamingは、システムが湾曲13の小さな半径を持つ液体-空気界面を持って確保することによってオーディオ周波数で達成することができます。チューブ内の溶液のマイクロリットルの容積のメニスカスの曲率の適切な小さい半径を提供します。オーディオ周波数の使用は、ハードウェアが安価と13の多彩なことができる、と彼らは標準的な実験室sonicatorsとすることができるように、核酸と他の生化学試薬が破損していないことを意味します。
Protocol
1。 RT反応をマイクロミキシング
- マイクロミキシングを持つRT反応を行う前に、RT反応の所望の温度にマイクロミキサーを平衡化します。
- 37内部のマイクロミキサーを置く° C（またはRTの供給業者が推奨する温度）RT反応の開始前に少なくとも1時間のためのインキュベーター。
- 入力のトータルRNA（例えば0.1-1pg/μl）、代わりにNG -μgの単一セルの金額を使用することを除いて、逆転写酵素の供給業者の（Promega社から例えばMMTV - RT、キアゲンからOmniscript）の指示にしたがってRTミックスを、設定するサプライヤーが推奨する量。
- 我々は標準的な滅菌ヌクレアーゼフリー200μL薄壁PCRチューブを使用してください。
- 彼らはミキシングの準備ができているとすぐに安全にマイクロミキサーに位置RTチューブ。マイクロミキサーは、RT反応の間、37℃のインキュベーターの内部に残るはず。
- マイクロミキシングの適切な周波数と振幅を選択します。この例では150Hzの使用。
- のマイクロミキサーを切り替えて、RT反応（60分）期間中、常にそれを残す。
- マイクロミキサーのスイッチをオフにし、RT反応が完了すると、RTのチューブを取り出します。
- 氷上でRTのチューブをセットし、そのような定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCRまたはリアルタイムPCR）として、さらにアプリケーションで通常どおり進みます。
2。代表的な結果：
RT反応のコンテキスト内でマイクロミキシングの利点は、他の混合方法（例えば、揺れボルテックスまたは粉砕）が使用されている場合に相対的cDNAの収量の増加です。これは、cDNAを用いて定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCRまたはリアルタイムPCR）のその後の分析により、例えば、見ることができます。図2Aは、直前のRTのインキュベーション（黒、"粉砕"にRT反応の粉砕に比べて最初の5分（青、"micromixed5"）または全体の60分間マイクロミキシングの効果（赤、"micromixed60"）を示しています）。この場合、前述のRT反応液量は25μlのであり、それはトータルRNAの2.5pg含まれている。 cDNAを表すNurr - 1 mRNAを検出するように設計されたプライマーを用いて定量PCRのトレースは、上記の表示され、平均値±この同じ実験の3反復で50％の最大蛍光に達するまでのサイクル数のSEMのは、以下にプロットされます。アスタリスクは、統計学的有意差（Tukeyの多重比較で、一方向ANOVA）を表します。粉砕に比べて大きな改善をもたらした前述のRT反応の最初の5分間マイクロミキシングは、前述のRT反応の全体の60分間マイクロミキシングのに対し、粉砕を介して非有意な改善をもたらしたことに注意すること、の大きさは約15定量PCRと同等であったサイクル、平均で。
マイクロミキシングのメリットも得、その後の定量PCR産物の融解曲線分析で見ることができます。図2Bに示す実験では、前述のRT反応の全体の60分間マイクロミキシングにのみ生産された最初の5分または粉砕のために一貫性のない定量PCRをマイクロミキシングのに対し、重複して試料中の一貫性のある定量PCRのシグナル（図2BA、2赤のトレース）となりましたトレース（図2BA、2青色のトレースと2本の黒い痕跡、それぞれ）。グレーのトレースは、定量PCRの反応から除外されたcDNAをしたネガティブコントロール（"NEG。"）です。この実験から、定量PCRの製品が（すなわち融解曲線分析）、その温度をランプによって変性されたそれは、適切なPCR産物（すなわち、mRNAのはるかに高い濃度が逆転写と定量PCRによって増幅された際に得られたものと同一であったアンプリコン、ことは明らかでしたデータは示されていないが）のみ60分（図2BB、2赤のトレース）のためにmicromixedされていた以下のRT反応存在していた。他のすべて（すなわちmicromixed5、粉砕およびネガティブコントロール）（例えばプライマーダイマー）の代替アンプリコンの製品を生成した。
図1標準的な実験RT反応へのマイクロミキシングを適用するためのプロトコルのフロー図。物理的原理に関与、マイクロミキサーとどのように社内のマイクロミキサーを構築するためのより詳しい説明を参照13,14に記載されています
図2。そうでなければ標準的な実験RT反応でmRNAの単一セルの量を構成するRT反応の前に適用されるマイクロミキシングのメリットを示す代表的な定量PCRデータ。Nurr - 1遺伝子をコードするcDNA表すmRNAを検出する定量PCRのトレースの例。前述のRT反応は、25μlの体積のトータルRNAの2.5pg含有し、℃で60分間、37℃インキュベーター中で行った。 RT反応は、Rの粉砕によって混合し、Tは、インキュベーション（黒痕跡、"粉砕"）する前に混ぜてRT反応の最初の5分間の間にmicromixed（青トレース、"micromixed5"）またはRT反応（赤いトレース、"micromixed60"の全体の60分間micromixed ）。平均±最大蛍光50％に達するために必要な定量PCRのサイクル数のSEMのは、この実験のn = 3の繰り返しのために以下にプロットされます。アスタリスクは有意差（Tukeyの多重比較を一元配置ANOVA）を示します。Bは Nurr - 1のcDNA産物、25μlの体積で、 トータルRNAの25pgを含むRT反応は、次のこの時間を調べるもう一つの定量PCR実験。定量PCRのトレース（）と同様に得られる定量PCR産物の融解曲線解析は（b）の異なる混合条件として使用されています。ないcDNAは前述のRT反応に含まれていないれたネガティブコントロールも（灰色の痕跡、"NEG。"）が含まれています。 mRNAのはるかに高い濃度でRT反応も行うと（b）micromixed60用（赤のトレース）の試料のものと同一の融解曲線のピークを（データは示さず）を製造した。
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Discussion
ここで説明する標準的な実験RT反応にマイクロミキシングのアプリケーションの方法は、もちろん、どのような方法（例えば、細胞溶解、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション）を経由して収穫されたmRNAを含むことができる。また、任意のブランドまたはRT試薬、任意の温度（マイクロミキサーの材料の許容範囲内）の種類、および任意の期間を含むことができる。例えば、我々は、ランダムヘキサマーまたはオリゴdTプライマーを構成するRT反応から改善されたcDNA収量を観察している。それは次の制約に適合する他の生化学的変換（例えば、DNAのハイブリダイゼーション15）にも適用される場合があります。現在の技術の主な制約は、反応が湾曲した液体 - 空気界面（例えばメニスカス）を形成するソリューションの小さな（マイクロリットル）ドロップ内で発生する必要があります。我々は日常的に、それぞれ、4.7以上6.9ミリメートルの曲率半径で半月板を生産する、200μL薄壁PCRチューブに10または25μlのボリュームを使用してください。これにより、異なるソリューション間のインタフェースを延長し、短いタイムスケール上の場所を取る拡散をできるドロップで設定する渦流のための一般的な要件です。この制約は、したがって、マイクロミキシングが使用される可能性のあるすべての状況に適用されます。確かに少量の使用は、しばしば入力の材料（例えばRNA、DNA）の量が制限されているので有利になることができる、加えて大幅な節約が他の試薬で行うことができます。 RT反応の収率を向上させるの特定のコンテキストでは、反応はまた、mRNAの制限量を含まなければならない。我々は、入力RNAの単セルの量を構成するマイクロミキシング標準研究室のRT反応が示されるNurr - 1以外の遺伝子を含め、約10〜100倍混合の標準的な方法（揺れ、ボルテックスまたは粉砕）上でそれらのcDNAの収量を増加させることが示されているここに14。我々はまた、この改善は入力RNAの濃度が14増加に伴って減少を示している。高いRNAの濃度で、マイクロミキシングの不在の普及率の増加はそれが低下する前より多くのmRNAをcDNAに変換されることを保証するため、おそらくこれはです。
マイクロミキシングの方法は、反応液に反応容器を介して音響信号の高忠実度伝送の恩恵を受ける。我々は、彼らが正確に使用される200μL薄壁PCRチューブに合わせてテーパ状であることがそのようなスピーカー（図1）を覆うアクリル板の混合穴を慎重に加工することによってこれを達成する助け。これにより、チューブとアクリル板と音響信号のため、最大化、伝送の間の接触を最大化。一つは、彼らが機械的な振動の結果として、混合中に出てくる可能性があるため、反応管がしっかりと混合穴内に保持されていることを確認する必要があります。
音響microstreamingの私たちの定義は、いくつかの現象論的にベースの定義がより可能性が広いです。しかし、むしろ現象論的にではなく、根本的にこれらのフローを分類ライリー16で良いレビューがあります。ナビエ - ストークス方程式の非線形項は二次では平均流が存在するように十分に大きくなければならない。この項は、速度の倍の速度勾配、我々はmicrostreaming流れを生じさせることができる速度が十分に小さく変化する以上の長さスケール（すなわち、十分に大きな速度勾配を作る）を作るために行うものですので。私たちの音響microstreamingベースのデバイスは、（"マイクロミキサー"）システムは、曲率13の小さな半径を持つ液体-空気界面を持って確保することによってオーディオ（すなわち低電力）の周波数で音響microstreamingが可能になります。対照的に、"音響流"は、しばしば大規模な速度（すなわちハイパワー）によって大きくした非線形項によって定義されます。私たちのケースでは、よく振動するように作られるの小さなドロップ;滴の表面張力は、一緒にその粘度で、13を混合するための有用な平均流を生成する役割を果たす可能性があります。実験はまた、大型（10 -100μmの）粒子は我々が使用するよりも大きな振動滴内で移動することができることが示されている、しかしこれは、粒子が17〜固有の別のメカニズムによって、おそらくです。
結論では、RNAの単セルの量を構成する標準的な実験RT反応にマイクロミキシングのアプリケーションは、劇的にそのcDNAの収量を増加させる効果的な方法です。この改善は、上と現在混合マイクロリットルのボリュームの使用可能なメソッドを（、揺れボルテックスまたは粉砕すなわち）使用して達成できること以上です。 RTを行うマイクロ流体ベースのデバイスは、我々自身を含め、他の状況で、大きな進歩であるとする多くの事情があるものの、単独でマイクロミキシングすると、さらに特殊な装置や方法を必要とせず大幅なと十分なメリットを提供します。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この研究はオーストラリアの国立保健医療研究評議会（プロジェクトの助成金がない。6288480）とスコビーとクレアマッキノントラストによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus Bioscience | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega Corp. | C1181 | |
| AMV-RT | Promega Corp. | M5101 | |
| dNTP set | Promega Corp. | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega Corp. | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
References
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