Summary
DT40 ، وهو نظام الفقاريات نموذج الجيني ، ويوفر أداة قوية لتحليل وظيفة البروتين. نحن هنا وصف طريقة بسيطة تسمح التحليل النوعي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي التوليف خلال المرحلة - S DT40 في الخلايا على مستوى جزيء واحد.
Abstract
الحفاظ على الاستقرار شوكة تكرار أمر في غاية الأهمية لتقسيم الخلايا للحفاظ على سلامة والوقاية من المرض. العمليات التي ينطوي ليس فقط ضمان المؤمنين الجينوم الازدواجية في مواجهة الحمض النووي من التلف الداخلية والخارجية ولكن أيضا منع عدم الاستقرار الجيني ، وهو عامل المسبب للمرض معترف بها في مجال التنمية الورم.
هنا ، نحن تصف المجهري المستندة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة مضان طريقة لتصور تكرار الحمض النووي في الخلية خط B - DT40 الطيور. هذا الخط الخلية يوفر أداة قوية لتحقيق وظيفة البروتين في الجسم الحي بواسطة الهندسة الوراثية المعكوسة في خلايا الفقاريات 1. تصوير تألقي في الحمض النووي الألياف DT40 خلايا تفتقر إلى جين معين يسمح احد لتوضيح وظيفة هذا المنتج الجيني في تكرار الحمض النووي واستقرار الجينوم. الطرق التقليدية لتحليل ديناميات شوكة تكرارها في خلايا الفقاريات تعتمد على قياس المعدل العام للتوليف الحمض النووي من السكان البالغ عددهم نبض الخلايا المسمى. هذا هو النهج الكمي ، ولا تسمح للتحليل النوعي للمعلمات التي تؤثر في تركيب الحامض النووي. في المقابل ، يمكن أن يتبع معدل حركة نشطة من الشوك مباشرة عند استخدام تقنية الحمض النووي الألياف 2-4. في هذا النهج ، هو المسمى DNA الوليدة في الجسم الحي بواسطة إدماج النيوكليوتيدات المهلجنة (الشكل 1A). بعد ذلك ، يتم تمدد الألياف الفردية على شريحة المجهر ، وأساء إلى تكرار الحمض النووي المسمى مساحات محددة مع الأجسام المضادة والتي تصور المجهري مضان (الشكل 1B). يتم تحديد بدء النسخ المتماثل وكذلك اتجاهها تفرع عن طريق استخدام اثنين من نظائرها على التوالي تعديل مختلف. وعلاوة على ذلك ، فإن النهج المزدوج الوسم يسمح التحليل الكمي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي التوليف خلال المرحلة - S ، أي تكرار هياكل مثل شوك الجارية والمتوقفة ، والنسخ الأصلية الكثافة وكذلك إنهاء الشوكة. أخيرا ، يمكن أن يكون الإجراء التجريبي إنجازإد في غضون يوم ، ويتطلب معدات المختبرات العامة وفقط المجهر مضان.
Protocol
وصف الأسلوب هنا تم استخدامه في المنشور التالي : شواب وآخرون ، EMBO J. ، 29 (4) :806 - 18 5.
1. DT40 خلية ثقافة
المواد : مصل بقري جنيني (FBS) ، والدجاج المصل ، البنسلين / الستربتومايسين ، 2 - المركابتويثانول ، RPMI
- إعداد خلية متوسطة الثقافة : إضافة FBS 7 ٪ و 3 ٪ مصل الدجاج ، 1X البنسلين / الستربتومايسين و 10 ميكرومتر 2 - المركابتويثانول لRPMI المتوسط.
- DT40 تزرع الخلايا في خلية ثقافة قوارير معقمة عند 38 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 في حاضنة مرطب. انقسام الخلايا في كل يوم الى كثافة 5 × 10 5 خلية / مل 6.
2. العلامات في الجسم الحي
المواد : إيدو ، CldU
- إعداد حلول المخزون من نظائرها النوكليوتيدات : حل إيدو إلى 5 ملم وCldU إلى 2.5 ملم في المتوسط. الحرارة على حد سواء لفترة وجيزة الحلول إلى 60 درجة مئوية ، ودوامة حتى التناظرية النوكليوتيداتتذاب UES تماما.
- إيدو إضافة إلى التركيز النهائي من 25 ميكرومتر إلى تزايد أضعافا مضاعفة DT40 الخلايا وخلط تعليق الخلية جيدا. احتضان خلايا لمدة 20 دقيقة عند 38 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- بعد حضانة مع التسمية الأولى ، إضافة إلى التركيز CldU النهائي من 250 ميكرومتر وعلاج الخلايا كما هو موضح في الخطوة السابقة.
- غسل الخلايا مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني وresuspend منهم في تركيز 7.5 × 5 10 خلايا / مل في برنامج تلفزيوني الباردة. إبقاء الخلايا المسمى على الجليد.
ووصف الإجراء الوسم هو مجرد اقتراح ويمكن تعديلها لمعالجة مسائل محددة. يرجى الرجوع إلى قسم المناقشة لمزيد من المعلومات حول التصميم التجريبي.
3. تحلل الخلية والحمض النووي نشر
المواد : شرائح الزجاج والألياف حل تحلل
- إعداد الحل تحلل الألياف : 50 مم وSDS EDTA 0.5 ٪ في 200 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5
- 7 الماصة حل تحلل ميكرولتر على رأس خلية تعليق ويحرك برفق مع طرف الماصة لمزج الحلول. احتضان لمدة 2 دقيقة لتحلل الخلية والمضي قدما.
- الميل إلى 15 درجة الشرائح للسماح للألياف إلى الانتشار على طول الشريحة.
- مرة واحدة في حل الألياف قد وصل إلى الجزء السفلي من الشريحة ، وضعه أفقيا لتجف في الهواء. بعد التجفيف ، ينبغي رقيقة ، خط مبهمة تكون مرئية على الشريحة. عند هذه النقطة ، يجب أن تكون وضعت في بداية الألياف امتدت مع قلم رصاص وبعد تلوين الخط سوف لا تكون مرئية لفترة أطول. وسوف تساعد هذه العلامة في وقت لاحق لتحديد موقع الألياف تحت المجهر.
4. المناعي تلطيخ
المواد : الميثانول ، وحمض الخليك ، حمض الهيدروكلوريك ، BSA 5 ٪ في برنامج تلفزيوني ، جرة تلطيخ ، ومكافحة BrdU (الماوس) الأضداد ،مكافحة BrdU (الجرذان) الضد والأغنام لمكافحة فأر Cy3 الأضداد ، الماعز مكافحة الفئران اليكسا فلور 488 الأضداد ، Vectashield المتوسطة المتصاعدة ، coverslips ، وطلاء الأظافر
- الشرائح تزج في الميثانول / حامض الخليك (3:1) في جرة تلطيخ واحتضان لمدة 10 دقيقة.
- تغسل الشرائح في المقطر O 2 H ، ثم تزج في حمض الهيدروكلوريك 2.5 M لمدة 80 دقيقة.
- تغسل شرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- إزالة الشرائح من الجرة تلطيخ وجمع برنامج تلفزيوني الزائد بمنشفة ورقية. ضع الشرائح أفقيا وBSA الماصة 5 ٪ على رأس كل شريحة. تغطية الشرائح بلطف مع ساترة لنشر جيش صرب البوسنة بالتساوي على الشريحة واحتضان لمدة 20 دقيقة.
- تمييع الأضداد الابتدائية في جيش صرب البوسنة 5 ٪ في التركيزات التالية : 1:25 مكافحة BrdU (الماوس) ، ومكافحة BrdU 1:400 (الجرذان).
- نقل ساترة بلطف أسفل الشريحة الزجاجية لإزالته. لا تنطبق على استخدام القوة اذا زلة تغطية العصي إلى الشريحة. يمكن ممهى الشريحة في برنامج تلفزيوني حتى تصبح فضفاضة ساترة anد يمكن إزالتها بسهولة. جمع BSA الزائدة مع منشفة ورقية ومكان الشرائح أفقيا. الماصة 50 ميكروليتر من محلول الأجسام المضادة الأولية على كل شريحة. مرة أخرى مع تغطية ساترة لنشر حل الضد بالتساوي على الشريحة واحتضان في غرفة مرطب لمدة 2 ساعة.
- بعد إزالة coverslips ، وتغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق
- تمييع الأضداد الثانوية في جيش صرب البوسنة 5 ٪ في التركيزات التالية : 1:500 الأغنام مكافحة فأر Cy3 1:400 والماعز لمكافحة الجرذان اليكسا فلور 488.
- تطبيق 50 ميكروليتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية كما هو موضح للأضداد الأولية. حماية الشرائح من الضوء واحتضان لمدة 1 ساعة.
- بعد إزالة coverslips ، وتغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- إضافة قطرة من المتوسط Vectashield المتصاعدة على كل شريحة وتطبيق ساترة. اضغط بلطف coverslips وإزالة السوائل الزائدة حولها مع منشفة ورقية. coverslips الختم مع بوليس الأظافر الشفاف ح والسماح لهم الجافة. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية.
5. اقتناء الصور
المواد : مضان المجهر والكاميرا
ضع قطرة من النفط الغمر على شريحة قريبة من العلامة قلم رصاص وبدء تحديد موقع الألياف. عادة ، هناك حزمة من الألياف الرئيسي ، ولكن هذه الألياف في شباكها جدا ولا يمكن تحليلها في وقت لاحق. الابتعاد عن حزمة الرئيسي للعثور على المناطق التي يتم فيها فصل واضح الألياف عن بعضها البعض (الشكل 2). سوف نختار الصور باستخدام قناة واحدة فقط اللون من أجل تجنب التحيز. ثم ، ونحن نأخذ ما يقرب من 10 صور في كل مرة نقطة ، وتركيز أو خط خلوي. ومع ذلك ، فإن عددا من الصور يعتمد على عدد الألياف ويمكن الاعتماد على كل صورة. تتحرك على طول الشريحة لالتقاط الصور المختلفة ، ومنطقة واحدة من شريحة قد لا توفر أطوال الألياف ممثل أو هياكل تكرارها.
6. تحليل البيانات
"jove_content"> المواد : صورة برنامج التحليل ، على سبيل المثال ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
استيراد الصور في صورة برنامج التحليل. قياس أطوال مساحات الألياف و / أو عدد النسخ هياكل مختلفة (الشكل 3). العد فقط الألياف التي هي واضحة للعيان والتي لا تمتد فوق حافة الصورة. عادة يمكننا قياس طول الألياف حوالي 100 شخص وعدد النسخ هياكل 150-200 ، وكنا نكرر تجارب فردية على الأقل ثلاث مرات.
7. ممثل النتائج :
الحمض النووي يمكن تصور تكرارها حديثا كخطوط من الأجسام المضادة المسماة نظائرها النوكليوتيدات. في تجاربنا ويمثل شوكة الجارية والمتاخمة إشارات حمراء وخضراء (الشكل 3). بروتوكول وضع العلامات المزدوجة كما يتيح لنا تحديد أربع فئات رئيسية للهياكل النسخ المتماثل : 1) يمكن البدء divid أحداث جديدة إد في أصول التي كانت تطلق في حين حضنت الخلايا مع التسمية الأولى وأصولها التي أطلقت خلال الحضانة مع التسمية الثانية. السابقة تتألف من إشارات خضراء والاحمر والاخضر المجاورة والأخير من الخط الأخضر فقط. 2) إنهاء الأحداث تظهر كإشارات الاحمر والاخضر والاحمر المجاور. 3) يتخلل أصول من المواقع في الجينوم مع أصول متباعدة عن كثب. وتتألف هذه المواقع من أصول واشارات متتالية الانهاء. 4) اعتمادا على تصميم تجريبي ، المتوقفة / يمكن إما انهارت الشوك لا يمكن تعريفها بأنها إشارة حمراء واحد فقط (7) أو خط أحمر تليها المسالك الخضراء 8،9 قصيرة.
استخدام الشروط المذكورة هنا ، نوع الخلايا البرية DT40 لها سرعة تفرع متوسط قدره 0.4 ميكرون / دقيقة. يمكننا الكشف عن حوالي 63 ٪ الشوك الجارية والأصول 10 ٪ ، 16 ٪ الشوك المتوقفة (مساحات فقط حمراء) ، الإنهاءات 8 ٪ و 3 ٪ ألياف تتخللها.
لدى عودتهم 1 "/>
الشكل 1 (أ) والجانب الأيسر من الرسوم المتحركة يصور الخطوة الأولى من الحمض النووي الداخلي العلامات : إضافة إلى الخلايا إيدو DT40 المتزايد باطراد يقود التماثلية النوكليوتيدات لإدراجها بسهولة في قيادة المركبة حديثا ومتخلفة جدائل الحمض النووي. ويمكن تصور هذا باستخدام الأجسام المضادة المحددة ، وسوف تبدو وكأنها خط أحمر عند عرضها تحت المجهر. بعد ذلك ، يتم تكرار نفس الإجراء مع CldU كما هو مبين على الجانب الأيمن من الشكل. بعد حضانة مع التماثلية والنوكليوتيدات الثانية ، ومن شأن الشوكة تكون مرئية نشط باعتباره السبيل الاحمر والاخضر المجاورة. طول الألياف متوسط يتناسب مع فترة حضانة لنظائرها النوكليوتيدات. (ب) ويمتد من الحمض النووي من خلايا DT40 lysed بواسطة الجاذبية على شريحة المجهر ونظائرها أدرجت النوكليوتيدات هي تصور عن طريق استخدام أجسام مضادة محددة ، والفحص المجهري مضان.
igure 2 "/>
الشكل 2. صورة ممثل مضان يظهر ألياف من الخلايا البرية DT40 النوع المسمى لاحقا مع وCldU إيدو لمدة 20 دقيقة لكل منهما. كذلك يتم فصل معظم الألياف عن بعضها البعض وبالتالي يمكن تحليلها بسهولة. شريط أبيض تمثل 10 ميكرون.
. الشكل 3 تقنية الألياف المزدوج الوسم يسمح احد للتمييز بين الهياكل النسخ المختلفة ؛ 1 -- شوك تكرار بنشاط ، 2 -- مواقع جديدة لتكرار الحمض النووي (اطلاق النار من أصول جديدة) ، 3 -- إنهاء شوكة (اثنان تتلاقى الشوك) ، 4 -- يتخلل الألياف (من أصول مواقع متباعدة عن كثب) و 5 -- شوك المتوقفة (إشارة حمراء فقط).
Discussion
نحن تصف الطريقة التي تسمح للتحليل الكمي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي خلال مرحلة التوليف - S في مستوى جزيء واحد. على مدى السنوات العشر الماضية ، تم وضع صيغ مختلفة للتصوير تألقي تقنية الحمض النووي الألياف لتصور حركة الشوك المتماثل الفردية داخل الخلايا الحية. المعلمة حاسما في كل هذه التقنيات هي الإجراءات المتبعة لتحقيق أفضل ما يمكن من الحمض النووي التي تمتد على الأسطح الزجاجية توفير ألياف الحمض النووي جيدا المشتتة. خطوة حاسمة لتحقيق هذا هو الوقت المناسب للحضانة وقف الخلية على الشريحة المجهر ، فضلا عن الوقت تحلل. هذه المعايير تعتمد على درجة الحرارة وتدفق الهواء في مختبر خاص ، وينبغي أن تحدد تجريبيا. عادة يتم إنجاز الجزء العملي للتجربة ألياف الحمض النووي خلال يوم واحد. ومع ذلك ، بعد اكتساب صورة والتحليل هو أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب الممارسة.
يمكن أن يكون بروتوكول وضع العلامات الإعلانيةapted للرد على المشاكل العلمية المختلفة : استخدام عامل الذي يتداخل مع تكرار خلال وضع العلامات نبض second مراقبين استطالة شوكة / المماطلة في الاستجابة للإجهاد تنسخي. وأضاف في هذا السيناريو ، التسمية الأولى لا تحتاج إلى أن تكون جرفت كما النوكليوتيدات الثانية في الزائدة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأدوية التي تعوق تطبيقها في تركيبة أو بعد إضافة التسمية الأولى. وهذا يتطلب التسمية الأولى ويطبق الدواء المراد إزالتها قبل التماثلية والنوكليوتيدات الثانية. هذا الإجراء يسمح احد لتحديد أهمية العوامل المختلفة إصلاح الحمض النووي على الاستقرار شوكة تنسخي / الانتعاش في ظل ظروف الضغط تنسخي (أي شوكة المماطلة و / أو انهيار). الجدير بالذكر أنه يمكن إجراء تحليل أكثر تفصيلا للتفاصيل ال DNA برنامج النسخ المتماثل مع استخدام أساليب بديلة لجمع الحمض النووي تمشيط ومضان والتهجين في الموقع. هذا ومع ذلك ، من الناحية التقنية أكثر تحديا ويتطلب expenSIVE المعدات.
القدرة على تحليل نوعيا وكميا تفاصيل تكرار الحمض النووي يوفر أداة أساسية لتحقيق عيوب في تكرار الحمض النووي في حد ذاته ، وكذلك الممرات التي تقمع عدم الاستقرار الجيني المرتبطة الشوك تكرارها. مما لا شك فيه ، فإن هذا الاختبار على مزيد من المساعدة لتسليط الضوء على آليات النسخ بوساطة إصلاح الحمض النووي التي تسمح للخلايا الطبيعية للرد / التكيف مع التغيرات البيئية وكذلك كيفية الاستفادة من هذه الخلايا السرطانية آليات لمقاومة سمية العقاقير التي تستهدف الشوك تكرارها.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكتور T. Helleday والدكتور بيترمان E. للحصول على مساعدة تقنية من الألياف وكذلك أعضاء في مختبر للمناقشة مفيدة. معتمد من قبل WN الزمالة الدولية للبحوث كبار من الرابطة الدولية لبحوث السرطان واللجنة الدولة البولندية للبحث العلمي المنح (N301 165935).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
- Petes, T. D., Williamson, D. H. Fiber autoradiography of replicating yeast DNA. Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).
- Takeuchi, F. Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells. Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H.
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
- Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40. Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).
