Summary
DT40, un sistema vertebrado modelo genético, proporciona una poderosa herramienta para analizar la función de proteínas. Aquí se describe un método sencillo que permite el análisis cualitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S en células DT40 en el nivel de moléculas individuales.
Abstract
Mantenimiento de la estabilidad de replicación tenedor es de suma importancia para la división de las células para preservar la viabilidad y prevenir enfermedades. Los procesos involucrados no sólo garantizar la duplicación del genoma fieles en la cara del daño del ADN endógeno y exógeno, sino también prevenir la inestabilidad genómica, un factor causal reconocido en el desarrollo tumoral.
A continuación, describimos un microscopio de fluorescencia basada en simple y rentable método para visualizar la replicación del ADN en las células B aviares línea DT40. Esta línea celular es una herramienta poderosa para investigar la función de proteínas in vivo mediante genética inversa en las células de vertebrados 1. Fluorografía ADN fibra en DT40 células que carecen de un gen específico permite dilucidar la función de este producto de genes en la replicación del ADN y la estabilidad del genoma. Los métodos tradicionales para analizar la dinámica de replicación tenedor en las células de vertebrados se basan en la medición de la tasa global de la síntesis de ADN en una población de células marcadas con pulso. Este es un enfoque cuantitativo y no permite un análisis cualitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN. En contraste, la tasa de movimiento de la horquilla activa se puede seguir directamente cuando se utiliza la técnica de fibra de ADN 4.2. En este enfoque, el ADN naciente está etiquetado en vivo por la incorporación de nucleótidos halogenados (Fig. 1A). Posteriormente, las fibras individuales se extienden en un portaobjetos de microscopio, y las vías de replicación de ADN marcado se tiñen con anticuerpos específicos y se visualizan por microscopía de fluorescencia (Fig. 1B). Iniciación de la replicación, así como la direccionalidad tenedor se determina por el uso consecutivo de dos análogos de diferente modificado. Además, el enfoque de doble etiquetado permite el análisis cuantitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S, es decir, la replicación de estructuras tales como tenedores en curso y se estancó, la densidad del origen de replicación, así como terminaciones tenedor. Por último, el procedimiento experimental se puede lograred en un día, y sólo requiere de equipos de laboratorio general y un microscopio de fluorescencia.
Protocol
El método descrito aquí se utilizó en la siguiente publicación: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 de cultivo celular
Materiales: suero fetal bovino (FBS), suero de pollo, la penicilina / estreptomicina, 2-mercaptoetanol, RPMI
- Preparar el medio de cultivo celular: añadir el 7% de SFB, el 3% suero de pollo, la penicilina 1x / estreptomicina y 10 mM 2-mercaptoetanol al medio RPMI.
- DT40 células se cultivan en frascos de cultivo celular estéril a 38 ° C y 5% de CO 2 en un incubador humidificado. Dividir celdas cada día a una densidad de 5 x 10 5 células / ml 6.
2. En vivo etiquetado
Materiales: UDI, CldU
- Preparar soluciones madre de los análogos de nucleótidos: disolver UDI a 5 mm y CldU a 2,5 mm de media. Calentar las soluciones brevemente a 60 ° C y agitar hasta que el análogo de los nucleótidosUES se disuelven por completo.
- Añadir UDI a una concentración final de 25 mM de crecimiento exponencial de las células DT40 y mezclar la suspensión celular también. Se incuban las células durante 20 minutos a 38 ° C y 5% CO 2.
- Después de la incubación con la primera etiqueta, añada CldU a una concentración final de 250 M y el tratamiento de las células como se describe en el paso anterior.
- Lavar las células con PBS enfriado con hielo y resuspender ellos en una concentración de 7,5 x 10 5 células / ml en PBS frío. Mantener las células marcadas en el hielo.
El procedimiento de etiquetado descrito es sólo una sugerencia y puede ser modificado para responder a preguntas específicas. Por favor refiérase a la sección de discusión para obtener más información sobre el diseño experimental.
3. Lisis celular y el ADN difusión
Materiales: láminas de vidrio, fibra de solución de lisis
- Prepare la solución de lisis de fibra: 50 mM EDTA y SDS al 0,5% en 200 mM Tris-HCl, pH 7,5
- Pipeta de solución de lisis 7 l en la parte superior de la suspensión celular y revuelva suavemente con la punta de la pipeta para mezclar las soluciones. Incubar durante 2 minutos para la lisis celular para continuar.
- Inclinación de diapositivas a 15 ° para permitir que las fibras se extienden a lo largo de la diapositiva.
- Una vez que la solución de fibra ha alcanzado la parte inferior de la diapositiva, coloque horizontalmente para secar al aire. Después del secado, una delgada línea, opaco debe ser visible a lo largo de la diapositiva. En este punto, el inicio de las fibras estiradas se debe marcar con un lápiz como después de la tinción de la línea no será visible por más tiempo. Esta marca posterior le ayudará a localizar las fibras en el microscopio.
4. La tinción de inmunofluorescencia
Materiales: metanol, ácido acético, ácido clorhídrico, 5% de BSA en PBS, jar manchas, anti-BrdU (ratón) de anticuerpos,anti-BrdU (ratón) de anticuerpos de oveja anti-ratón Cy3 anticuerpo de cabra anti-rat Alexa Fluor 488 anticuerpos, Vectashield medio de montaje, cubreobjetos, esmalte de uñas
- Sumerja los portaobjetos en metanol / ácido acético (3:1) en una cubeta y se incuba durante 10 minutos.
- Lavar los portaobjetos en agua destilada H 2 O, y luego sumergirse en 2,5 M de HCl durante 80 minutos.
- Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos.
- Retirar los portaobjetos de la cubeta y recoger el exceso de PBS con una toalla de papel. Colocar los portaobjetos en sentido horizontal y BSA pipeta de 5% en la parte superior de cada diapositiva. Cubrir los portaobjetos suavemente con un cubreobjetos para difundir la BSA de manera uniforme sobre la diapositiva y se incuba durante 20 minutos.
- Diluir los anticuerpos primarios en el 5% de BSA en las siguientes concentraciones: 1:25 anti-BrdU (ratón) y 1:400 anti-BrdU (rata).
- Mover el cubre suavemente el portaobjetos de vidrio para eliminarlo. No aplicar la fuerza si la hoja de la cubierta se adhiere a la diapositiva. La diapositiva puede ser rehidratada en PBS hasta que el cubreobjetos se suelta unad se puede quitar con facilidad. Recoger BSA exceso con una toalla de papel y la desliza horizontalmente. Pipeta de 50 l de la solución de anticuerpo primario en cada diapositiva. Cubrir de nuevo con un cubreobjetos para difundir la solución de anticuerpos de manera uniforme sobre la diapositiva y se incuban en una cámara húmeda durante 2 horas.
- Después de retirar el cubreobjetos, este lavado tres veces en PBS durante 5 minutos
- Diluir los anticuerpos secundarios en el 5% de BSA en las siguientes concentraciones: 1:500 de oveja anti-ratón Cy3 y 1:400 de cabra anti-rat Alexa Fluor 488.
- Aplique 50 l de la solución de anticuerpo secundario como se describe para los anticuerpos primarios. Proteger a las diapositivas de la luz y se incuba durante 1 hora.
- Después de retirar el cubreobjetos, este lavado tres veces en PBS durante 5 minutos.
- Agregar una gota de medio Vectashield montaje en cada diapositiva y colocar un cubreobjetos. Presione suavemente el cubreobjetos y eliminar el exceso de líquido alrededor de ella con una toalla de papel. Sello cubreobjetos con uñas transparente polish y déjelos secar. Tienda de las diapositivas a -20 ° C.
5. De adquisición de imágenes
Materiales: cámara microscopio de fluorescencia,
Ponga una gota de aceite de inmersión en un portaobjetos cerca de la marca del lápiz y empezar a localizar las fibras. Por lo general, hay un haz de fibras principales, pero estas fibras son demasiado enredado y no puede ser analizado más adelante. Aléjese del paquete principal para encontrar áreas en las que las fibras están claramente separados el uno del otro (Fig. 2). Queremos seleccionar las imágenes que sólo utiliza un canal de color con el fin de evitar el sesgo. Luego, tomaría aproximadamente 10 imágenes de cada línea de tiempo del punto, la concentración o celular. Sin embargo, el número de imágenes depende de muchas fibras se pueden contar en cada imagen. Se mueven a lo largo de la diapositiva para tomar las fotos diferentes, como un área de la diapositiva no puede proporcionar la longitud de fibra o de las estructuras representativas de replicación.
6. Análisis de datos
Materiales: Imagen del programa de análisis, por ejemplo, ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
Importar imágenes en un programa de análisis de imagen. Medir las longitudes de los tramos de fibra y / o el recuento de las estructuras de reproducción diferentes (Fig. 3). Sólo cuentan las fibras que son claramente visibles y que no se extienden sobre el borde de la imagen. Por lo general medir la longitud de alrededor de 100 fibras y el recuento de 150 a 200 estructuras de reproducción y que se repiten los experimentos individuales por lo menos tres veces.
7. Los resultados representativos:
ADN recién replicado se puede visualizar como líneas de anticuerpos marcados con análogos de nucleótidos. En nuestros experimentos un tenedor en curso se representa como adyacentes señales rojas y verdes (Fig. 3). El protocolo de doble etiquetado también nos permite definir cuatro tipos principales de estructuras de repetición: 1) nuevos eventos de iniciación se puede divi ed los orígenes que han disparado mientras que las células se incubaron con la primera etiqueta y origen que se han disparado durante la incubación con la segunda etiqueta. Los primeros constan de vecinos verde-rojo-verde de señales y el último de una línea verde solamente. 2) eventos de terminación se manifiestan como al lado de color rojo-verde-rojo señales. 3) origen entremezclados son los sitios en el genoma de origen muy próximas entre sí. Tales sitios constan de orígenes consecutivos y señales de terminación. 4) en función del diseño experimental, se estancó / horquillas colapsado se puede definir como una señal en rojo sólo el 7 o una línea roja seguida de una zona verde de 8,9 a corto.
Usando las condiciones descritas aquí, las células de tipo salvaje DT40 tienen una velocidad promedio de tenedor de 0,4 m / min. Podemos detectar aproximadamente el 63% se bifurca en curso, el origen del 10%, 16% de las horquillas se estancó (rojo vías únicamente), terminaciones 8% y 3% de fibras entremezcladas.
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. Figura 1 (A) El lado izquierdo de la caricatura representa el primer paso del procedimiento de marcaje de ADN: la adición de UDI de crecimiento exponencial de las células DT40 conduce el análogo de nucleótido que se incorpora fácilmente a la líder de nueva síntesis, y quedando las hebras de ADN. Esto puede ser visualizado mediante el uso de un anticuerpo específico, y aparecerá como una línea roja cuando se observa bajo el microscopio. Posteriormente, el mismo procedimiento se repite con CldU como se muestra en la parte derecha de la figura. Después de la incubación con el análogo de los nucleótidos en segundo lugar, un tenedor de activos será visible como un adjunto rojo-verde las vías. La longitud de fibra media es proporcional a la duración de la incubación de los análogos de nucleótidos. (B) de ADN de las células lisadas DT40 se estira por la gravedad sobre un portaobjetos de microscopio y los análogos de nucleótidos incorporados son visualizados por el uso de anticuerpos específicos y microscopía de fluorescencia.
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Figura 2. Una imagen de fluorescencia muestra representativa de las fibras de tipo salvaje células DT40 posteriormente etiquetados con UDI y CldU durante 20 minutos cada uno. La mayoría de las fibras están bien separadas unas de otras y por lo tanto se puede analizar con facilidad. La barra blanca representa el 10 micras.
. Figura 3 La técnica de fibra de doble etiquetado permite distinguir entre las estructuras de reproducción diferentes, 1 - horquillas de replicación activa, 2 - los nuevos sitios de replicación del ADN (lanzamiento de nuevos orígenes), 3 - terminaciones tenedor (dos tenedores de convergencia), 4 - fibras entremezcladas (lugares de orígenes muy próximas entre sí) y 5 - las horquillas se estancó (sólo señal de color rojo).
Discussion
Se describe un método que permite el análisis cuantitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S en un nivel sola molécula. En los últimos diez años, las diferentes versiones de la técnica del ADN fluorografía fibra se han desarrollado para visualizar el movimiento de las horquillas de replicación individuales dentro de las células vivas. El parámetro crítico en todas estas técnicas es el procedimiento utilizado para obtener el mejor estiramiento de ADN en superficies de vidrio proporciona bien separadas las fibras de ADN. Un paso crucial para lograr esto es el tiempo de incubación de la suspensión de células en el portaobjetos de un microscopio, así como el tiempo de lisis. Estos parámetros dependen de la temperatura y el flujo de aire en un laboratorio particular y debe ser determinada empíricamente. La parte práctica de un experimento de fibra de ADN se realiza generalmente en un día. Sin embargo, la adquisición de imágenes y análisis posteriores es más tiempo y requiere práctica.
El protocolo de etiquetado puede ser adApted para responder a diversos problemas científicos: el uso de un agente que interfiere con la replicación en el etiquetado segundo pulso monitores elongación tenedor / estancamiento en respuesta al estrés replicativo. En este escenario, la primera etiqueta no necesita ser lavado como el segundo de nucleótidos, se añade en exceso. Por otra parte, los fármacos que impiden la replicación se puede utilizar en combinación o sólo después de la adición de la primera etiqueta. Esto requiere de la primera etiqueta y la droga que se elimina antes de que el análogo de los nucleótidos segundo se aplica. Este procedimiento permite determinar la importancia de algunos factores de reparación del ADN en la estabilidad replicativa tenedor / recuperación en condiciones de estrés replicativo (tenedor es decir, estancamiento y / o colapso). Digno de mención, un análisis más detallado de los pormenores del programa de la replicación del ADN se podría realizar con el uso de una combinación de enfoques alternativos de ADN peinado y la fluorescencia de hibridación in situ. Esto, sin embargo, es técnicamente más difícil y requiere gastosequipos intensiva.
La capacidad de analizar cualitativa y cuantitativamente los detalles de la replicación del ADN proporciona una herramienta esencial para la investigación de los defectos en la replicación del ADN en sí, así como las vías que suprimir la inestabilidad genómica asociada con las horquillas de replicación. Sin lugar a dudas, esta prueba también ayudará a arrojar luz sobre los mecanismos de replicación mediada por la reparación del ADN que permiten a las células normales de respuesta / adaptación a los cambios ambientales, así como la forma en las células cancerígenas utilizan estos mecanismos para resistir la toxicidad de los fármacos que se dirigen las horquillas de replicación.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Se agradece al Dr. T. Helleday y el Dr. E. Petermann para ayudar con la técnica de fibra, así como los miembros del laboratorio útil para el debate. WN con el apoyo de una Beca de Investigación Internacional Senior de la Asociación para la Investigación Internacional del Cáncer y por el Comité de Estado polaco de Investigación Científica de subvención (165.935 N301).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
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