Summary
DT40, een model gewerveld genetisch systeem, biedt een krachtig hulpmiddel om eiwit functie te analyseren. Hier beschrijven we een eenvoudige methode die kwalitatieve analyse van de parameters die invloed hebben DNA-synthese in de S-fase in DT40-cellen op de single molecule-niveau mogelijk maakt.
Abstract
Het onderhoud van de replicatie vork stabiliteit is van het grootste belang is voor delende cellen om de levensvatbaarheid te behouden en ziekte te voorkomen. De processen zorgen niet alleen voor gelovigen genoomduplicatie in het gezicht van de endogene en exogene DNA-schade, maar ook voorkomen dat genomische instabiliteit, een erkende oorzakelijke factor in de ontwikkeling van tumoren.
We beschrijven hier een eenvoudige en kosteneffectieve fluorescentie microscopie gebaseerde methode om DNA-replicatie te visualiseren in het aviaire B-cellijn DT40. Deze cellijn is een krachtig hulpmiddel om de functies van eiwitten in vivo te onderzoeken door middel van omgekeerde genetica in gewervelde cellen 1. DNA fiber fluorografie in DT40 cellen ontbreekt een specifiek gen maakt het mogelijk om ophelderen van de functie van dit gen product in DNA replicatie en stabiliteit van het genoom. Traditionele methoden om de replicatie vork dynamiek te analyseren in vertebrate cellen vertrouwen op het meten van de totale percentage van DNA-synthese in een populatie van puls-gemerkte cellen. Dit is een kwantitatieve benadering en staat niet toe dat voor de kwalitatieve analyse van de parameters die invloed hebben DNA-synthese. In tegenstelling, kan de snelheid van het verkeer van actieve vorken direct worden gevolgd bij het gebruik van de DNA-techniek vezel 2-4. In deze aanpak, is ontluikende DNA gelabeld in vivo door het opnemen van gehalogeneerde nucleotiden (afb. 1A). Vervolgens worden de individuele vezels uitgerekt op een microscoopglaasje, en het gelabelde DNA-replicatie traktaten zijn gekleurd met specifieke antilichamen en gevisualiseerd door fluorescentie microscopie (afb. 1B). Aanvang van de replicatie en vork gerichtheid wordt bepaald door de opeenvolgende gebruik van twee verschillende gewijzigd analogen. Bovendien is de dual-labelling aanpak maakt het mogelijk voor de kwantitatieve analyse van de parameters die invloed hebben DNA-synthese in de S-fase, dat wil zeggen replicatie structuren zoals permanente en vastgelopen vorken, oorsprong van replicatie dichtheid en vork opzeggingen. Tot slot kan de experimentele procedure te volbrengened binnen een dag, en vereist alleen algemene laboratoriumbenodigdheden en een fluorescentie microscoop.
Protocol
De hier beschreven methode werd gebruikt in de volgende publicatie: Schwab et al., EMBO J., 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 celcultuur
Materialen: Foetale bovine serum (FBS), kip serum, penicilline / streptomycine, 2-mercaptoethanol, RPMI
- Bereid celkweekmedium: voeg 7% FBS, 3% kip serum, 1x penicilline / streptomycine en 10 uM 2-mercapto-ethanol aan RPMI medium.
- DT40-cellen worden gekweekt in steriele celkweek kolven bij 38 ° C en 5% CO 2 in een bevochtigde incubator. Cellen splitsen elke dag een dichtheid van 5 x 10 5 cellen / ml 6.
2. In vivo labeling
Materialen: Idu, CldU
- Bereid voorraad oplossingen van nucleotide-analogen: los IDU tot 5 mm en CldU tot 2,5 mM in medium. Warmte beide oplossingen kort tot 60 ° C en vortex tot de nucleotide analoogUES volledig is opgelost.
- Voeg IDU tot een uiteindelijke concentratie van 25 uM tot exponentieel groeiende DT40-cellen en meng de celsuspensie. Incubeer cellen gedurende 20 minuten bij 38 ° C en 5% CO 2.
- Na incubatie met het eerste label, voeg CldU tot een uiteindelijke concentratie van 250 uM en behandelen cellen zoals beschreven in de vorige stap.
- Was de cellen met ijskoude PBS en resuspendeer ze bij een concentratie van 7,5 x 10 5 cellen / ml in koude PBS. Houd de gelabelde cellen op ijs.
De beschreven etikettering procedure is slechts een suggestie en kan worden aangepast om specifieke vragen te beantwoorden. Raadpleeg de discussie sectie voor meer informatie over de experimentele design.
3. Cellysis en DNA verspreiden
Materiaal: Glas dia's, fiber lysis oplossing
- Bereid de vezel lysis oplossing: 50 mM EDTA en 0,5% SDS in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5
- Pipet 7 ul lysis-oplossing op de top van de celsuspensie en voorzichtig roeren met de pipet tip om de oplossingen te mengen. Incubeer gedurende 2 minuten voor cellysis om door te gaan.
- Kantelen dia's tot 15 °, zodat de vezels te verspreiden langs de dia.
- Nadat de vezel oplossing heeft bereikt de onderkant van de schuif, horizontaal plaats het aan de lucht drogen. Na het drogen, moet een dunne, ondoorzichtige lijn zichtbaar langs de dia. Op dit punt, moet het begin van het gestrekte vezels worden gemarkeerd met een potlood als na het kleuren van de lijn niet zichtbaar meer. Dit teken zal later helpen om de vezels onder de microscoop te vinden.
4. Immunofluorescentiekleuring
Materialen: Methanol, azijnzuur, HCl, 5% BSA in PBS, vlekken pot, anti-BrdU (muis) antilichaam,anti-BrdU (rat) antilichaam, schapen anti-muis Cy3 antilichaam, geit anti-rat Alexa Fluor 488 antilichaam, Vectashield montage medium, dekglaasjes, nagellak
- Dompel dia's in methanol / azijnzuur (3:1) in een kleuring pot en incubeer gedurende 10 minuten.
- Was dia's in gedestilleerd H 2 O, vervolgens onder te dompelen in 2,5 M HCl gedurende 80 minuten.
- Was de dia's drie keer in PBS gedurende 5 minuten.
- Verwijder dia's uit de kleuring pot en het verzamelen van overtollige PBS met een papieren handdoek. Horizontaal plaatsen van de dia's en pipet 5% BSA op de top van elke dia. Voorzichtig Bedek de dia's met een dekglaasje aan de BSA gelijkmatig verdeeld over de glijbaan en gedurende 20 minuten incuberen.
- Verdun de primaire antilichamen in 5% BSA bij de volgende concentraties: 01:25 anti-BrdU (muis) en 1:400 anti-BrdU (rat).
- Beweeg het dekglaasje naar beneden het glaasje om het te verwijderen. Oefen geen druk als het dekglas kleeft aan de dia. De dia kan worden gehydrateerd in PBS tot het dekglaasje wordt los eend kan worden verwijderd met gemak. Vangt overtollige BSA met een papieren handdoek en horizontaal plaatsen van de dia's. Pipetteer 50 ul van de primaire antilichaam oplossing op elke dia. Bedek opnieuw met een dekglaasje aan het antilichaam oplossing gelijkmatig verdeeld over de glijbaan en in een vochtige kamer voor 2 uur incuberen.
- Na het verwijderen van de dekglaasjes, was de dia's drie keer in PBS gedurende 5 minuten
- Verdun de secundaire antilichamen in 5% BSA bij de volgende concentraties: 1:500 schaap anti-muis Cy3 en 1:400 geit anti-rat Alexa Fluor 488.
- Van toepassing zijn 50 ui van het secundaire antilichaam oplossing als beschreven voor de primaire antilichamen. Bescherm de dia's van licht en incubeer gedurende 1 uur.
- Na het verwijderen van de dekglaasjes, was de dia's drie keer in PBS gedurende 5 minuten.
- Voeg een druppel Vectashield montage medium op elke dia en breng een dekglaasje aan. Druk de dekglaasjes en verwijder overtollig vocht omheen met een papieren handdoek. Seal coverslips met transparante nagel polish en laat ze drogen. Bewaar de dia's bij -20 ° C.
5. Beeldacquisitie
Materialen: fluorescentie microscoop, camera
Plaats een druppel immersie olie op een dia de buurt van het potlood merk en start het lokaliseren van de vezels. Meestal is er een van de belangrijkste vezel bundel, maar deze vezels zijn te verward en kan later niet worden geanalyseerd. Ga uit de buurt van de belangrijkste bundel naar gebieden waar vezels duidelijk gescheiden zijn van elkaar (fig. 2) te vinden. Wij zouden u foto's alleen met behulp van een kleurkanaal om vertekening te voorkomen. Dan zouden we ongeveer 10 foto's van elk tijdstip, concentratie of cellijn. Echter, het aantal foto's hangt af van hoeveel vezels kunnen worden geteld op elke foto. Bewegen langs de glijbaan naar de verschillende foto's te maken, als een deel van een dia kan geen representatief vezels lengtes of replicatie structuren.
6. Data-analyse
Materialen: Beeld analyse programma, bijvoorbeeld ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
Foto's importeren in een beeld analyse programma. Meet de lengte van de vezel traktaten en / of tellen de verschillende replicatie-structuren (afb. 3). Tellen alleen vezels die duidelijk zichtbaar zijn en die niet uitstrekken over de rand van het beeld. We meten meestal de lengte van ongeveer 100 vezels en tel 150-200 replicatie structuren en we zouden herhalen individuele experimenten minstens drie keer.
7. Representatieve resultaten:
Nieuw DNA gerepliceerd kan worden gevisualiseerd als lijnen van antilichaam-gelabeld nucleotide analogen. In onze experimenten een voortdurende vork wordt voorgesteld als aangrenzende rode en groene signalen (afb. 3). De dubbele etikettering-protocol maakt het ook mogelijk ons te definiëren vier grote klassen van replicatie structuren: 1) nieuwe initiatie evenementen kunnen worden divid ed in de oorsprong die zijn afgevuurd, terwijl de cellen werden geïncubeerd met het eerste etiket en de oorsprong die zijn afgevuurd tijdens de incubatie met het tweede label. De voormalige bestaan uit aangrenzende groen-rood-groen-signalen en de laatste van een groene lijn alleen. 2) de beëindiging gebeurtenissen zich manifesteren als aangrenzende rood-groen-rood signalen. 3) afgewisseld oorsprong zijn plaatsen in het genoom met dicht op elkaar staande oorsprong. Dergelijke sites bestaan uit opeenvolgende oorsprong en beëindiging signalen. 4) Afhankelijk van de proefopzet, vastgelopen / ingestort vorken kan gedefinieerd als een rode signaal slechts 7 of een rode lijn, gevolgd door een korte groen-darmkanaal 8,9 te zijn.
Met behulp van de voorwaarden hier beschreven, wild-type DT40 cellen hebben een gemiddelde snelheid vork van 0,4 micrometer / min. We kunnen ongeveer 63% te detecteren lopende vorken, 10% afkomst, 16% geblokkeerde vorken (rood alleen traktaten), 8% opzeggingen en 3% afgewisseld vezels.
ure 1 "/>
. Figuur 1 (A) De linker kant van de cartoon toont de eerste stap van de DNA-etikettering procedure: het toevoegen van IDU exponentieel groeiende DT40 cellen leidt de nucleotide analoog gemakkelijk worden opgenomen in de nieuw gesynthetiseerde toonaangevende en achterblijvende DNA-strengen. Dit kan worden gevisualiseerd door middel van een specifiek antilichaam, en wordt weergegeven als een rode lijn wanneer bekeken onder de microscoop. Vervolgens wordt dezelfde procedure herhaald met CldU zoals op de rechterkant van de figuur. Na incubatie met de tweede nucleotide analoog, zal een actieve vork zichtbaar als een aangrenzende rood-groen-darmkanaal. De gemiddelde vezellengte is evenredig met de incubatietijd van de nucleotide-analogen. (B) DNA van gelyseerde DT40-cellen wordt uitgerekt door de zwaartekracht op een objectglaasje en de ingebouwde nucleotide analogen worden gevisualiseerd door het gebruik van specifieke antilichamen en fluorescentie microscopie.
igure 2 "/>
Figuur 2. Een vertegenwoordiger fluorescentie beeld toont vezels van wild-type DT40-cellen vervolgens gelabeld met IDG en CldU gedurende 20 minuten elk. De meeste van de vezels zijn goed van elkaar gescheiden en kunnen dus gemakkelijk worden geanalyseerd. De witte balk geeft 10 micrometer.
. Figuur 3 De dubbele-etikettering fiber techniek maakt het mogelijk een onderscheid te maken tussen de verschillende replicatie structuren; 1 - actief te repliceren vorken, 2 - nieuwe sites van de DNA-replicatie (het afvuren van nieuwe afkomst), 3 - vork opzeggingen (twee convergerende vorken), 4 - afgewisseld vezels (sites van dicht bij elkaar gelegen afkomst) en 5 - vastgelopen vorken (alleen rood signaal).
Discussion
We beschrijven een methode die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve analyse van de parameters die DNA-synthese invloed tijdens de S-fase bij een enkel molecuul niveau. In de afgelopen tien jaar werden verschillende versies van de DNA-vezel fluorografie techniek ontwikkeld om de beweging van de individuele replicatie vorken in levende cellen te visualiseren. De kritische parameter in al deze technieken is de procedure die wordt gebruikt om de best mogelijke uitrekken van DNA te bereiken op een glazen ondergrond het verstrekken van goed gescheiden DNA vezels. Een cruciale stap om dit te bereiken is de incubatietijd van de celsuspensie op de microscoop glijbaan en lysis tijd. Deze parameters zijn afhankelijk van de temperatuur en de luchtstroom in een bepaald laboratorium en moet empirisch worden bepaald. Het praktische deel van een DNA-vezel experiment is meestal bereikt binnen een dag. Echter, de volgende foto acquisitie en analyse is meer tijdrovend en vereist oefening.
De etikettering protocol kan worden adApted aan diverse wetenschappelijke problemen te beantwoorden: met behulp van een agent die met replicatie ingrijpt tijdens de tweede puls etikettering monitoren vork rek / stalling in reactie op replicatieve stress. In dit scenario, het eerste label hoeft niet te worden uitgewassen als tweede nucleotide wordt in overmaat toegevoegd. Als alternatief kunnen geneesmiddelen die de replicatie belemmeren worden gebruikt in combinatie of net na toevoeging van het eerste etiket. Dit vereist het eerste etiket en het geneesmiddel te worden verwijderd voordat de tweede nucleotide analoog wordt toegepast. Deze procedure maakt het mogelijk om vast te stellen het belang van verschillende factoren op de DNA-herstel replicatieve vork stabiliteit / herstel onder omstandigheden van replicatieve stress (dat wil zeggen vork stalling en / of collaps). Opmerkelijk, zou een meer gedetailleerde analyse van gegevens van de DNA-replicatie-programma worden uitgevoerd met het gebruik van een alternatieve benaderingen te combineren DNA kammen en de fluorescentie in situ hybridisatie. Dit is echter, is technisch meer uitdagende en vereist uitgavensieve apparatuur.
De mogelijkheid om kwalitatief en kwantitatief te analyseren gegevens van DNA-replicatie biedt een essentieel instrument voor het onderzoeken van defecten in DNA-replicatie zelf als de paden die genomische instabiliteit in verband met replicatie vorken te onderdrukken. Ongetwijfeld zal deze test verder helpen om licht te werpen op de mechanismen van replicatie-gemedieerde DNA reparatie die het mogelijk maken normale cellen om te reageren op / om veranderingen in het milieu aan te passen en hoe kankercellen gebruik maken van deze mechanismen om de toxiciteit van geneesmiddelen gericht op replicatie vorken weerstaan.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken dr. T. Helleday en dr. E. Petermann voor hulp met de vezel techniek, alsmede de leden van het lab voor nuttige discussie. WN wordt ondersteund door een Senior International Research Fellowship van de Association for Cancer Research International en door de Poolse staat Comite voor Wetenschappelijk Onderzoek-subsidie (N301 165935).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
- Petes, T. D., Williamson, D. H. Fiber autoradiography of replicating yeast DNA. Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).
- Takeuchi, F. Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells. Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H.
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
- Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40. Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).
