Summary
DT40, un sistema modello vertebrato genetico, fornisce un potente strumento per analizzare la funzione delle proteine. Qui si descrive un metodo semplice che permette l'analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S in DT40 cellule a livello di singola molecola.
Abstract
Mantenimento della stabilità replica forcella è della massima importanza per la divisione delle cellule per preservare la vitalità e prevenire le malattie. I processi coinvolti non solo garantire la duplicazione del genoma fedeli di fronte a danni al DNA endogeno ed esogeno, ma anche prevenire l'instabilità genomica, un fattore riconosciuto causale nello sviluppo del tumore.
Qui, descriviamo un microscopio a base semplice e conveniente fluorescenza metodo per visualizzare la replicazione del DNA nelle cellule B aviaria linea DT40. Questa linea cellulare fornisce un potente strumento per studiare la funzione delle proteine in vivo dalla genetica inversa nelle cellule dei vertebrati 1. Fibra Fluorografia DNA in cellule DT40 manca un gene specifico permette di chiarire la funzione di questo prodotto del gene nella replicazione del DNA e la stabilità del genoma. I metodi tradizionali per analizzare le dinamiche forcella di replicazione nelle cellule dei vertebrati si basano sulla misurazione del tasso globale di sintesi del DNA in una popolazione di cellule etichettate impulsi. Si tratta di un approccio quantitativo e non consente per l'analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA. Al contrario, il tasso di circolazione delle forche attivo può essere seguito direttamente quando si utilizza la tecnica del DNA in fibra di 2-4. In questo approccio, il DNA nascente è etichettato in vivo per incorporazione di nucleotidi alogenati (Fig. 1A). Successivamente, le singole fibre sono allungati su un vetrino da microscopio, e con l'etichetta tratti di replicazione del DNA sono colorate con anticorpi specifici e visualizzati al microscopio a fluorescenza (Fig. 1B). Avvio di replica e direzionalità forcella è determinato mediante l'uso consecutivo di due analoghi diversamente modificati. Inoltre, la doppia etichettatura approccio permette di analisi quantitativa di parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S, ovvero la replica di strutture quali le forcelle in corso e in fase di stallo, l'origine densità replica così come terminazioni forchetta. Infine, la procedura sperimentale può essere realizzareed in un giorno, e richiede solo attrezzature generali di laboratorio e un microscopio a fluorescenza.
Protocol
Il metodo qui descritto è stato utilizzato nel seguente pubblicazione: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 coltura cellulare
Materiali: siero fetale bovino (FBS), pollo siero, penicillina / streptomicina, 2-mercaptoetanolo, RPMI
- Preparare terreno di coltura cellulare: aggiungere 7% FBS, 3% di siero di pollo, 1 penicillina / streptomicina e 10 mM 2-mercaptoetanolo e medie RPMI.
- DT40 cellule sono coltivate in contenitori sterili colture cellulari a 38 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Dividere le celle ogni giorno per una densità di 5 x 10 5 cellule / ml 6.
2. Nella etichettatura vivo
Materiali: Idu, CldU
- Preparare soluzioni di analoghi nucleotidici: sciogliere Idu a 5 mm e CldU a 2,5 mm in mezzo. Calore entrambe le soluzioni brevemente a 60 ° C e fino a quando il vortice analogico nucleotideUES sono sciolti completamente.
- Aggiungi IDU ad una concentrazione finale di 25 mM di crescita esponenziale DT40 cellule e mescolare bene la sospensione cellulare. Incubare le cellule per 20 minuti a 38 ° C e 5% di CO 2.
- Dopo l'incubazione con la prima etichetta, aggiungere CldU ad una concentrazione finale di 250 micron e curare le cellule, come descritto nel passaggio precedente.
- Lavare le cellule con PBS freddo ghiaccio e risospendere loro ad una concentrazione di 7,5 x 10 5 cellule / ml in PBS freddo. Mantenere le cellule etichettate sul ghiaccio.
La procedura di etichettatura descritto è solo un suggerimento e può essere modificato per rispondere alle domande specifiche. Si prega di fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori informazioni sul design sperimentale.
3. Lisi delle cellule e del DNA diffusione
Materiali: lastre di vetro, fibra di soluzione di lisi
- Preparare la soluzione in fibra di lisi: 50 mM EDTA e 0,5% SDS in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5
- Pipettare 7 soluzione di lisi microlitri in cima alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente con la punta della pipetta per miscelare le soluzioni. Incubare per 2 minuti per lisi cellulare per procedere.
- Inclinazione diapositive a 15 ° per permettere di diffondere le fibre lungo lo scivolo.
- Una volta che la soluzione in fibra ha raggiunto la parte inferiore della diapositiva, è posto orizzontalmente per asciugare all'aria. Dopo l'essiccazione, una linea sottile, opaco dovrebbe essere visibile lungo la diapositiva. A questo punto, l'inizio delle fibre tese deve essere contrassegnato con una matita come dopo colorazione la linea non sarà più visibile. Questo marchio sarà poi aiutare a individuare le fibre al microscopio.
4. Immunofluorescenza
Materiali: metanolo, acido acetico, acido cloridrico, 5% BSA in PBS, vaschetta di colorazione, anti-BrdU (topo) di anticorpi,anti-BrdU (ratto) di anticorpi, di pecora anti-topo Cy3 anticorpi di capra anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpi, media Vectashield montaggio, coprioggetto, smalto per le unghie
- Immergere i vetrini in metanolo / acido acetico (3:1) in una vaschetta di colorazione e incubare per 10 minuti.
- Lavare i vetrini in acqua distillata H 2 O, quindi immergere in 2,5 M HCl per 80 minuti.
- Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti.
- Rimuovere diapositive dalla vaschetta di colorazione e raccogliere PBS in eccesso con un tovagliolo di carta. Porre i vetrini in senso orizzontale e BSA pipetta 5% su ogni diapositiva. Coprire le diapositive delicatamente con un coprioggetto per diffondere la BSA uniformemente sulla slitta e incubare per 20 minuti.
- Diluire gli anticorpi primari nel 5% BSA alle concentrazioni seguenti: 1:25 anti-BrdU (topo) e 1:400 anti-BrdU (ratto).
- Spostare il vetrino dolcemente il vetrino per rimuoverlo. Non forzare se la polizza di copertura bastoni alla diapositiva. La presentazione può essere reidratato in PBS fino a quando il vetrino si allenta unod possono essere rimossi con facilità. Raccogliere BSA in eccesso con un tovagliolo di carta e porre le slide orizzontale. Pipettare 50 ml di soluzione di anticorpo primario su ogni diapositiva. Coprire di nuovo con un coprioggetto per diffondere la soluzione di anticorpi uniformemente sul vetrino e incubare in una camera umidificata per 2 ore.
- Dopo aver rimosso il coprioggetto, lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti
- Diluire gli anticorpi secondari nel 5% BSA alle seguenti concentrazioni: 1:500 pecora anti-topo Cy3 e 1:400 capra anti-topo Alexa Fluor 488.
- Applicare il 50 microlitri della soluzione di anticorpo secondario come descritto per gli anticorpi primari. Proteggere le diapositive dalla luce e incubare per 1 ora.
- Dopo aver rimosso il coprioggetto, lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti.
- Aggiungere una goccia di medium Vectashield montaggio su ogni diapositiva e applicare un vetrino coprioggetti. Premere delicatamente il coprioggetto e rimuovere il liquido in eccesso attorno ad esso con un tovagliolo di carta. Coprioggetto sigillo trasparente con unghie polish e lasciarle asciugare. Conservare i campioni a -20 ° C.
5. Acquisizione di immagini
Materiali: microscopio a fluorescenza, fotocamera
Mettere una goccia di olio di immersione in una diapositiva accanto al simbolo di matita e di localizzare l'origine delle fibre. Di solito, c'è un fascio di fibre principale, ma queste fibre sono troppo invischiati e non possono essere analizzati successivamente. Allontanarsi dal fascio principale per individuare le aree dove le fibre sono chiaramente separate le une dalle altre (Fig. 2). Vorremmo selezionare solo le immagini utilizzando un canale di colore in modo da evitare distorsioni. Poi, ci sarebbe di circa 10 foto di ogni linea del tempo punto di concentrazione o di cellule. Tuttavia, il numero di immagini dipende da quante fibre può contare su ogni foto. Muovetevi lungo lo scivolo per le riprese fotografiche differenti, come una zona di una diapositiva non possono fornire lunghezze fibra di rappresentanza o strutture di replica.
6. Analisi dei dati
Materiale: analisi del programma Picture, ad esempio ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
Importare immagini in un programma di analisi dell'immagine. Misura la lunghezza dei tratti di fibre e / o contare le strutture di replica diversi (Fig. 3). Contano solo le fibre che sono chiaramente visibili e che non si estendono oltre il bordo della foto. Noi di solito misurare la lunghezza di circa 100 fibre e contano 150-200 strutture replica e vorremmo ripetere gli esperimenti individuali almeno tre volte.
7. Rappresentante dei risultati:
DNA appena replicato possono essere visualizzati come linee di anticorpi marcati con analoghi nucleotidici. Nei nostri esperimenti una forcella in corso è rappresentato come adiacente segnali rosso e verde (Fig. 3). Il protocollo di doppia marcatura ci permette anche di definire quattro classi principali di strutture replica: 1) eventi nuova iniziazione può essere Divid ed in origini che hanno sparato mentre le cellule sono state incubate con la prima etichetta e le origini che hanno sparato durante l'incubazione con la seconda etichetta. I primi consistono in vicine verde-rosso-verde i segnali e il secondo di una linea verde solo. 2) cessazione eventi si manifestano come adiacente rosso-verde-rosso segnali. 3) intervallati origini sono siti nel genoma di origine ravvicinati. Tali siti sono costituiti di origini consecutivi e segnali di terminazione. 4) a seconda del disegno sperimentale, in fase di stallo / forche crollato può essere definito come un segnale rosso solo 7 o una linea rossa seguita da un breve tratto verde 8,9.
Utilizzando le condizioni qui descritte, le cellule di tipo selvatico DT40 hanno una velocità media forchetta di 0,4 micron / min. Siamo in grado di rilevare circa il 63% forchette in corso, il 10% origini, il 16% forchette in fase di stallo (rosso tratti solo), l'8% e il 3% terminazioni delle fibre intervallati.
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. Figura 1 (A) La parte sinistra del cartone animato rappresenta il primo passo della procedura di etichettatura del DNA: l'aggiunta di Idu a crescita esponenziale DT40 cellule porta l'analogo nucleotidico ad essere facilmente incorporati nella guida di nuova sintesi e in ritardo di sviluppo filamenti di DNA. Questo può essere visualizzato utilizzando un anticorpo specifico, e apparirà come una linea rossa se visto sotto il microscopio. Successivamente, la stessa procedura si ripete con CldU come mostrato sul lato destro della figura. Dopo l'incubazione con l'analogo secondo nucleotide, una forcella attivo sarà visibile come un adiacente tratto rosso-verde. La lunghezza media delle fibre è proporzionale al tempo di incubazione degli analoghi nucleotidici. (B) del DNA da cellule lisate DT40 è teso dalla forza di gravità su un vetrino da microscopio e gli analoghi nucleotidici incorporato vengono visualizzati mediante l'uso di anticorpi specifici e microscopia a fluorescenza.
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Figura 2. Un'immagine rappresentativa fluorescenza mostra fibre di tipo selvaggio DT40 cellule in seguito etichettati con IDU e CldU per 20 minuti ciascuno. La maggior parte delle fibre sono ben separati gli uni dagli altri e può quindi essere facilmente analizzati. La barra bianca rappresenta 10 micron.
. Figura 3 La doppia etichettatura in fibra tecnica permette di distinguere tra le strutture di replica diversi; 1 - forche attivamente replicando, 2 - nuovi siti di replicazione del DNA (lancio di nuove origini), 3 - cessazioni fork (due forchette convergenti), 4 - fibre intervallati (siti di origini ravvicinati) e 5 - forcelle in stallo (solo segnale rosso).
Discussion
Descriviamo un metodo che permette di analisi quantitativa di parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S a livello di singola molecola. Negli ultimi dieci anni, diverse versioni della tecnica del DNA Fluorografia fibra sono stati sviluppati per visualizzare il movimento delle forche replica singoli all'interno delle cellule viventi. Il parametro fondamentale in tutte queste tecniche è la procedura utilizzata per ottenere la migliore possibile allungamento del DNA sulle superfici di vetro che fornisce ben separate le fibre del DNA. Un passo fondamentale per raggiungere questo obiettivo è il tempo di incubazione della sospensione cellulare sul vetrino da microscopio così come il tempo lisi. Questi parametri dipendono dalla temperatura e flusso d'aria in un laboratorio di particolare e dovrebbe essere empiricamente determinato. La parte pratica di un esperimento in fibra di DNA in genere viene eseguita entro un giorno. Tuttavia, l'acquisizione dell'immagine e successive analisi è più tempo e richiede pratica.
Il protocollo di etichettatura può essere annuncioApted per rispondere a vari problemi scientifici: con un agente che interferisce con la replica durante l'etichettatura secondo impulso monitor allungamento forcella / stallo in risposta allo stress replicativo. In questo scenario, la prima etichetta non ha bisogno di essere lavati come il nucleotide è aggiunto il secondo in eccesso. In alternativa, i farmaci che impediscono la replicazione può essere usato in combinazione o appena dopo l'aggiunta della prima etichetta. Ciò richiede la prima etichetta e il farmaco deve essere rimosso prima l'analogo secondo nucleotide è applicata. Questa procedura permette di determinare l'importanza di diversi fattori di riparazione del DNA sulla stabilità replicativa forcella / recupero in condizioni di stress replicativo (forcella cioè stallo e / o collasso). Degno di nota, un'analisi più dettagliata dei particolari del programma di replicazione del DNA potesse essere eseguita con l'uso di un approccio alternativo che combina DNA e la pettinatura ibridazione in situ fluorescente. Questo però, è tecnicamente più impegnativo e richiede speseattrezzature SIVE.
La capacità di analizzare qualitativamente e quantitativamente le indicazioni della replicazione del DNA offre uno strumento essenziale per studiare i difetti nella replicazione del DNA stesso, come pure i percorsi che sopprimono l'instabilità genomica associata con forche di replica. Indubbiamente, questo saggio sarà ulteriormente aiutare a far luce sui meccanismi di replicazione mediata riparazione del DNA che permettono alle cellule normali di rispondere / adattarsi ai cambiamenti ambientali e come le cellule tumorali utilizzano questi meccanismi per resistere alla tossicità dei farmaci destinati forche replica.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il dottor T. Helleday e Dott. E. Petermann per aiutare con la tecnica della fibra così come i membri del laboratorio di discussione utile. WN è supportata da un Senior Fellowship Research International presso l'Associazione per la Ricerca sul Cancro Internazionale e dal Comitato di Stato polacco per la ricerca scientifica di sovvenzione (N301 165935).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
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