Summary
DT40, модель позвоночных генетической системы, предоставляет мощный инструмент для анализа функции белка. Здесь мы опишем простой метод, который позволяет качественный анализ параметров, влияющих на синтез ДНК в S-фазе в DT40 клеток на одном уровне молекулы.
Abstract
Поддержание стабильности репликации вилка имеет первостепенное значение для деления клеток, чтобы сохранить жизнеспособность и предотвратить болезнь. Процессы, связанные не только обеспечивают верные дублирования генома в условиях эндогенных и экзогенных повреждений ДНК, но и предотвратить нестабильность генома, признанных причинным фактором в развитии опухоли.
Здесь мы описываем простые и экономически эффективные флуоресцентной микроскопии основе метода визуализации репликации ДНК в птичьем B-клеточной линии DT40. Эта клеточная линия представляет собой мощный инструмент для исследования функции белка в естественных условиях на обратной генетики у позвоночных клетки 1. ДНК-волокна флюорографии в DT40 клетки не хватает конкретных генов позволяет выяснить функции этого продукта гена в репликации ДНК и стабильности генома. Традиционные методы анализа динамики репликации вилкой в клетках позвоночных полагаться на измерения общего уровня синтеза ДНК в популяции импульсно-меченых клеток. Это количественный подход и не позволяет для качественного анализа параметров, влияющих на синтез ДНК. В противоположность этому, скорость движения активной вилки можно проследить непосредственно при использовании техники ДНК волокна 2-4. При таком подходе, зарождающегося ДНК обозначена в естественных условиях путем введения галогенированные нуклеотидов (рис. 1А). Впоследствии отдельные волокна растягиваются на предметное стекло микроскопа, и помечены участки репликации ДНК являются витражи со специфическими антителами и визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 1б). Начало репликации, а также вилки направленность определяется последовательное использование двух по-разному модифицированные аналоги. Кроме того, двойная маркировка подход позволяет для количественного анализа параметров, влияющих на синтез ДНК в S-фазе, т.е. репликации структур, таких как текущие и застопорился вилки, плотность репликации происхождения, а также вилки окончаний. Наконец, экспериментальная процедура может выполнитьред в течение дня, и требует лишь общие лабораторного оборудования и флуоресцентного микроскопа.
Protocol
Описанный здесь метод был использован в следующей публикации: Шваб и др., EMBO J., 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 культуре клеток
Материалы: эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), куриные сыворотки, пенициллина / стрептомицина, 2-меркаптоэтанол, RPMI
- Подготовка среду клеточной культуры: добавить 7% FBS, 3% куриных сыворотки, 1x пенициллина / стрептомицина и 10 мкМ 2-меркаптоэтанола и среднего RPMI.
- DT40 клетки выращивают в стерильных колбах культуре клеток при 38 ° С и 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе. Разбить ячейки каждый день, чтобы плотность 5 х 10 5 клеток / мл 6.
2. В естественных условиях маркировки
Материалы: ПИН, CldU
- Подготовка растворы нуклеотидных аналогов: растворить ПИН до 5 мм и CldU до 2,5 мм в среде. Тепло оба решения кратко до 60 ° С и вихревые до аналогом нуклеотидовЕЭС растворяются полностью.
- Добавить ПИН до конечной концентрации 25 мкМ до экспоненциально растущей DT40 клетки и смешать клеточной суспензии хорошо. Инкубируйте клетки в течение 20 минут при 38 ° С и 5% CO 2.
- После инкубации с первым лейблом, добавьте CldU до конечной концентрации 250 мкМ и лечить клетки, как описано в предыдущем шаге.
- Вымойте клеток с ледяным PBS и ресуспендируют их в концентрации 7,5 х 10 5 клеток / мл в холодном PBS. Держите меченых клеток на льду.
Процедура, описанная маркировка является лишь предложением и могут быть изменены по решению конкретных вопросов. Пожалуйста, обратитесь к обсуждению раздел для получения дополнительной информации по экспериментальным дизайном.
3. Лизису клеток и ДНК распространения
Материалы: стекло слайды, решение волокна лизис
- Подготовка волокна решение лизис: 50 мМ ЭДТА и 0,5% SDS в 200 мМ Трис-HCl, рН 7,5
- Внесите 7 мкл раствора лизис в верхней части клеточной суспензии и осторожно перемешать с кончика пипетки для смешивания растворов. Выдержите в течение 2 минут для лизиса клеток для продолжения работы.
- Tilt слайды до 15 °, чтобы волокна распространяться по слайду.
- Как только решение волокна достигло нижней части слайда, поместите его горизонтально высохнуть на воздухе. После высыхания, тонкая, непрозрачная линия должна быть видна по слайду. На данный момент, в начале растянутых волокон, должны быть помечены карандашом, как после окрашивания линии не будет видно больше. Этот знак позже поможет найти волокна под микроскопом.
4. Иммунофлуоресценции окрашивания
Материалы: метанол, уксусная кислота, HCl, 5% BSA в PBS, окрашивание банку, анти-BrdU (мыши) антитела,анти-BrdU (крыса) антител, овец анти-мышиных антител Cy3, козий анти-крыса Alexa Fluor 488 антитела, Vectashield монтажа среды, покровные, лак для ногтей
- Погрузитесь слайдов в метанол / уксусная кислота (3:1) в банке окрашивания и инкубировать в течение 10 минут.
- Вымойте слайды в дистиллированной H 2 O, а затем погружают в 2,5 М HCl в течение 80 минут.
- Вымойте слайды три раза в PBS в течение 5 минут.
- Удалить слайды из окрашивание банку и собирать избыток PBS с бумажным полотенцем. Место слайды по горизонтали и пипеткой 5% BSA в верхней части каждого слайда. Обложка слайды осторожно покровное распространяться BSA равномерно по слайду и инкубировать в течение 20 минут.
- Развести первичных антител в 5% BSA в следующих концентрациях: 1:25 анти-BrdU (мыши) и 1:400 анти-BrdU (крыса).
- Перемещение покровное мягко вниз стекло для его удаления. Не применяйте силу, если покровное стекло прилипает к слайду. Слайд может быть регидратации в ФСБ пока покровное становится свободнымг могут быть удалены с легкостью. Сбор избыточного БСА с бумажным полотенцем и поместить слайды по горизонтали. Внесите 50 мкл первичных антител решение на каждом слайде. Обложка снова с покровным распространяться раствора антител равномерно по слайду и инкубировать во влажной камере в течение 2 часов.
- После удаления покровные, мыть слайды три раза в PBS в течение 5 минут
- Развести вторичными антителами в 5% BSA в следующих концентрациях: 1:500 овец антимышиным Cy3 и 1:400 козьего анти-крыса Alexa Fluor 488.
- Применить 50 мкл вторичных решение антител, как описано для первичных антител. Защита слайды от света и инкубировать в течение 1 часа.
- После удаления покровные, мыть слайды три раза в PBS в течение 5 минут.
- Добавить каплю Vectashield монтажа среды на каждом слайде и применять покровное. Аккуратно нажмите покровные и удалить лишнюю жидкость вокруг нее с бумажным полотенцем. Печать покровных с прозрачными ногтями полисч и дайте им высохнуть. Магазин слайды при температуре -20 ° C.
5. Image Acquisition
Материалы: флуоресцентный микроскоп, фотоаппарат
Место каплю иммерсионного масла на слайде рядом с карандашом марки и начать размещение волокон. Как правило, есть основной расслоения, но эти волокна тоже запутались и не могут быть проанализированы позже. Отойдите от основного пучка, чтобы найти области, где волокна четко отделены друг от друга (рис. 2). Мы хотели выбрать изображения, используя только один цветовой канал, чтобы избежать предвзятости. Затем мы займет примерно 10 фотографий в каждой строке момент времени, концентрации или клетку. Тем не менее, количество снимков зависит от того, сколько волокна, можно пересчитать по каждой картине. Двигайтесь вдоль слайд принимать разные картины, как одна из областей слайд не может предоставить представитель длины волокна или репликации структур.
6. Анализ данных
Материалы: Изображение анализ программы, например ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
Импорт фотографий в программе анализа изображения. Измерьте длину волокна путей и / или счета различных структур репликации (рис. 3). Только подсчет волокон, которые хорошо видны и которые не выходят за край картины. Мы обычно измеряют длину около 100 волокон и считать 150-200 структур репликации, и мы будем повторять отдельные эксперименты по крайней мере три раза.
7. Представитель Результаты:
Новый реплицируется ДНК могут быть визуализированы в виде линий антител, меченных нуклеотидных аналогов. В наших экспериментах текущих вилка представлена в виде смежных красного и зеленого сигналов (рис. 3). Двойная маркировка протокол также позволяет нам определить четыре основных класса репликации структур: 1) событие новое посвящение может быть divid ред в истоках, которые пускали в то время как клетки инкубировали с первым лейблом и происхождения, которые пускали в течение инкубационного со второй этикетки. Бывший состоят из соседних зеленый-красный-зеленый сигналы и последний из зеленой линии только. 2) прекращение событий проявляется в виде прилегающих красный-зеленый-красный сигналы. 3) перемежаются происхождение сайты в геноме с близко расположенными происхождения. Такие сайты состоят из последовательных происхождении и прекращении сигналов. 4) в зависимости от опытно-конструкторских, застопорился / рухнул вилки может быть определена как красный сигнал только 7 или красной линии следуют короткие зеленые тракта 8,9.
Использование условий, описанных здесь, дикого типа DT40 клетки средняя скорость вилкой 0,4 мкм / мин. Мы можем обнаружить около 63% текущих вилок, 10% происхождение, 16% застопорился вилки (только красным путей), 8% окончаний и 3% вкрапленные волокна.
рисунке 1 "/>
. Рисунок 1 (А) левая часть мультфильма показан первый шаг процедуры маркировки ДНК: добавление ПИН к экспоненциально растущей DT40 клеток приводит нуклеотидного аналога быть легко включены в недавно синтезированных ведущими и отстающими ДНК. Это могут быть визуализированы с помощью специфических антител, и будет выглядеть как красная линия, если смотреть под микроскопом. Впоследствии же процедура повторяется с CldU, как показано на правой части рисунка. После инкубации с второй нуклеотидных аналогов, активный вилка будет видно, как прилегающих красный-зеленый-кишечного тракта. Средняя длина волокна пропорциональна времени инкубации нуклеотидных аналогов. (B) ДНК из клетки лизируются DT40 растягивается под действием силы тяжести на предметное стекло и включили нуклеотидных аналогов визуализируются с помощью специфических антител и флуоресцентной микроскопии.
Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. Представителем флуоресценции изображение показывает волокна от дикого типа DT40 клетки впоследствии помечены ПИН и CldU в течение 20 минут каждый. Большинство волокна хорошо отделены друг от друга и тем самым могут быть легко проанализированы. Белая полоса составляет 10 мкм.
. Рисунок 3 двойной маркировки волокна методика позволяет различать между различными структурами репликации, 1 - активное тиражирование вилки, 2 - новые сайты репликации ДНК (стрельба новых происхождения), 3 - вилка окончаний (два сходящихся вилки), 4 - вкрапленные волокна (сайты близкие по происхождению) и 5 - тупик вилки (только красным сигналом).
Discussion
Мы опишем метод, который позволяет для количественного анализа параметров, влияющих на синтез ДНК в S-фазе при одном уровне молекулы. За последние десять лет, различные версии флюорографии техника волокна ДНК были разработаны для визуализации движения отдельных вилки репликации внутри живых клеток. Критическим параметром во всех этих методов является процедура, используемая для достижения наилучшего возможного растяжения ДНК на стеклянных поверхностях обеспечение хорошо разделенных волокна ДНК. Важный шаг к достижению этого является времени инкубации клеточной суспензии на предметное стекло микроскопа, а также лизис времени. Эти параметры зависят от температуры и воздушного потока в частности лаборатории и должен быть определен эмпирически. Практическая часть эксперимента волокна ДНК, как правило, осуществляется в течение одного дня. Однако последующие приобретения картину и анализ является более трудоемким и требует практики.
Маркировка протокол может быть объявлениеЭптид чтобы ответить на различные научные проблемы: с помощью агента, который препятствует репликации во время второго импульса маркировки мониторов вилка удлинение / сваливания в ответ на репликативной стресса. В этом случае, первая метка не должна быть промыта в качестве второго нуклеотидных добавляется в избытке. Кроме того, препараты, которые препятствуют репликации могут быть использованы в комбинации или просто после добавления первой этикетки. Это требует первая метка и наркотиками должны быть удалены перед вторым нуклеотидных аналогов применяется. Эта процедура позволяет определить значение различных факторов репарации ДНК в репликативной вилке стабильности / восстановления в условиях репликативной стресса (то есть вилкой сваливания и / или коллапс). Примечательно, что более детальный анализ особенностей программы репликации ДНК может быть выполнена с использованием альтернативных подходов, объединяющих ДНК расчесывание и флуоресценции в гибридизация. Это, однако, является технически более сложным и требует expenSIVE оборудования.
Способность качественно и количественно проанализировать сведения о репликации ДНК обеспечивает необходимый инструмент для исследования дефектов в репликации ДНК сама, а также пути, которые подавляют геномной нестабильности, связанные с репликацией вилки. Несомненно, этот анализ будет и далее способствовать, чтобы пролить свет на механизмы репликации опосредованного репарации ДНК, которые позволяют нормальным клеткам реагировать / адаптироваться к изменениям окружающей среды, а также как раковые клетки используют эти механизмы, чтобы противостоять токсичности препаратов ориентации репликации вилки.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Т. Helleday и д-р Э. Петерманн за помощь в волокна техники, а также члены лаборатории за полезные обсуждения. WN поддерживается старшим Международного братства исследований из Ассоциации по исследованию рака и Международной польского комитета Государственного научно-исследовательского гранта (N301 165935).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
- Petes, T. D., Williamson, D. H. Fiber autoradiography of replicating yeast DNA. Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).
- Takeuchi, F. Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells. Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H.
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
- Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40. Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).
