Summary
والانشطار الخميرة ،
Abstract
المجهري تقنيات عدة متوافرة اليوم التي يمكن الكشف عن بروتين معين داخل الخلية. خلال العقد الماضي أصبح يعيش التصوير الخلية باستخدام fluorochromes مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) يعلق مباشرة على البروتين من الاهتمام الشعبي على نحو متزايد 1. ويمكن استخدام GFP fluorochromes مماثلة يتم الكشف عن اللغات المحلية التحت خلوية وتحركات البروتينات في المجهر الفلورسنت. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن تدرس توطين subnuclear في منطقة معينة من الكروموسوم باستخدام هذه التقنية. وتنصهر GFP للبروتين كاظمة لاك (LacR) ، وأعرب عن ectopically في الخلية حيث تم إدخال يكرر جنبا إلى جنب من تسلسل lacO في المنطقة ذات الاهتمام على الكروموزوم 2. سوف LacR - GFP ربط lacO ويكرر هذا المجال من الجينوم سيكون مرئيا باعتبارها نقطة خضراء في مضان المجهر. وهي ملائمة بشكل خاص الخميرة لهذا النوع من التلاعب منذ مثليوالتوحد هو فعالة جدا ويمكن بالتالي التكامل المستهدفة من يكرر lacO والبروتينات الانصهار هندسيا مع GFP 3. نحن هنا وصف الأسلوب الكمي لتحليل الخلية الحية من الخميرة الانشطار. ويمكن الاطلاع على بروتوكولات إضافية لتحليل الخلية الحية من الخميرة الانشطار ، على سبيل المثال على كيفية صنع فيلم من 4 السلوك الكروموسومات الانتصافي. في هذه التجربة خاصة ونحن نركز على تنظيم subnuclear وكيف يتأثر أثناء تحريض الجينات. وصفت لنا كتلة الجين المسمى Chr1 ، عن طريق استحداث مواقع lacO ملزمة في المنطقة المجاورة للجينات. غير المخصب الكتلة الجين لجينات التي يسببها الجوع في وقت مبكر خلال النيتروجين من الخميرة الانشطار 5. في سلالة يسمى الغشاء النووي (NM) عن طريق الحجز على mCherry إلى NM Cut11 البروتين مما يؤدي إلى الإشارات الحمراء الفلورسنت. وتنصهر في الجسم القطب المغزل (SPB) مجمع Sid4 لبروتين فلوري الأحمر (Sid4 - mRFP) 6 7. تم تحديد هيكل وSPB جولة واسعة في شمال البحر الأبيض المتوسط. بواسطة التصوير قبل وبعد 20 دقيقة من مصدر استنزاف النيتروجين يمكننا تحديد المسافة بين الكتلة الجين (GFP) وNM / SPB. وتتم مقارنة المسافات يعني أو الوسيط قبل وبعد استنفاد النيتروجين ، ويمكننا بالتالي تحديد ما إذا كان أو لم يكن هناك تحولا في توطين التحت خلوية من الكتلة الجين بعد استنفاد النيتروجين.
Protocol
1. الانشطار الخميرة الثقافة
- تعد وسائل الإعلام الحد الأدنى ادنبره (EMM) وبدون EMM ammoniumchloride (EMM - N) 8. للحد من تألق ذاتي ينبغي أن الحل لا يكون الغلوكوز تعقيمها ولكن بدلا من ذلك تصفية تعقيمها باستخدام ميكرومتر 0.2 تصفية وأضاف في وقت لاحق الى وسائل الاعلام تعقيمها.
- تلقيح خلايا الخميرة الانشطار نمت حديثا على صفيحة آغار مع الوسائط الغنية ، والموافقة 8 ، في 3 مل من وسائل الاعلام مع الجلوكوز السائل EMM تعقيمها التصفية. استخدام أنابيب 13mL مع دفع برفق على الغطاء لضمان التهوية الجيدة للخلايا. السماح للخلايا تنمو بنسبة تهتز لهم 225 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية. يتبع لمدة 2 يوم بواسطة عد لها باستخدام غرفة Burker بواسطة التخفيف المناسبة ، كل صباح ومساء -- إبقاء الخلايا في مرحلة النمو السجل (2 X 10 7 خلية / مل 1 10 X 6).
- في يوم من التجربة تأكد من أن الخلايا في مرحلة مبكرة سجل (5) ، X 06-01 أكتوبر X 10 7 خلية / مل.
- لتجويع رانه لخلايا النيتروجين خلال التبديل 20 دقيقة من وسائل الاعلام لEMM EMM - N وسائل الإعلام. قد يتم ذلك عن طريق حصاد 3 مل من الخلايا في أنبوب 1.5 مل إيبندورف في اجهزة الطرد المركزي مقاعد البدلاء في أعلى إطار التعاون الإقليمي والحد الأقصى 1.5 الطرد المركزي بسرعة أكبر لحث على الاستجابة للضغط النفسي في الخميرة الانشطار 9. استخدام تقنية مزدوجة الغزل ، وهذا يعني ، تدور الأولى لل2 دقيقة ، ثم أعد تشغيل أنبوب إيبندورف 180 درجة وتدور مرة أخرى لمدة 1.5 دقيقة 2 RCF 10. هذا يساعد على جمع كافة الخلايا في واحدة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. يغسل مرة واحدة مع EMM - N وتذوب ثم بيليه في EMM - N واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 30 درجة مئوية في 225 دورة في الدقيقة تهتز ثم تابع إلى نقطة 2. نموذج التحضير.
2. إعداد نموذج
- قد الحصاد 1.5 مل من الخلايا في أنبوب 1.5 مل إيبندورف في اجهزة الطرد المركزي مقاعد البدلاء في أعلى إطار التعاون الإقليمي والحد الأقصى 1.5 الطرد المركزي بسرعة أكبر لحث على الاستجابة للضغط النفسي في الخميرة الانشطار 9. استخدام تقنية مزدوجة الغزل وميانينانوغرام ، الأولى تدور لمدة 2 دقيقة ، ثم أعد تشغيل أنبوب إيبندورف 180 درجة وتدور مرة أخرى لمدة 2 1.5 RCF 10 دقيقة. هذا يساعد على جمع كافة الخلايا في واحدة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
- إزالة طاف ، ولكن ترك 10-15 ميكروليتر وresuspend الخلايا المتبقية في وسائل الإعلام. بدلا من إضافة 10 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة لresuspend الكرية الخلية.
- تأكد من أن الشرائح الزجاجية واضحة والغطاء الزجاجي (لا 1.5). عادة لم يكن لديك لتنظيفها ، ولكن تأكد من أنها ليست مليئة بالغبار.
- أخرج من الفريزر an قسامة حل سهم lectin 1mg/mL التي تم تعقيمها التصفية. يمكن أن يكون الحل lectin refrozen بضع مرات. يستخدم lectin لإصلاح خلايا الخميرة في كوب الغطاء.
- 5 ميكرولتر من مكان EMM مع الجلوكوز تعقيم تصفية على زجاج الهدف.
- مكان 5 ميكرولتر من محلول lectin في زاوية من الزجاج غطاء. المكان في وقت لاحق 5 ميكرولتر الثقافة الخلية في الزاوية نفسها ، أي في إسقاط lectin. انتشار المزيج بواسطة pipetting بضع مرات ثم الخلية الثقافة lectin مزيج من الزجاج تغطي جميع أنحاء باستخدام الجانب طويلة من غيض ماصة. اعتمادا على كثافة الخليط صومعتك ترك كل شيء أو تمتص السيولة الفائضة في الزاوية المقابلة من الزجاج غطاء.
- وضع غطاء من الزجاج ، حتى أعلى ، مع جانب واحد على زجاج موضوعية وعلى الجانب الآخر على مقاعد البدلاء. السماح لتغطية الزجاج الجافة قليلا لبضع دقائق. بالتأكيد لا ينبغي أن تكون جافة تماما ، ولكن لا ينبغي أن يكون السائل كثيرا على الزجاج.
- وضع غطاء من الزجاج مع ملاكا التقريبية · 70 من الزجاج الهدف من قطرة من EMM. ترك غطاء من الزجاج بحيث تقع أعلى إلى أسفل في قطرة من EMM.
- وختم حواف مع الشحوم السيليكون تحضير حقنة 2 مل. قطع نهاية واسعة من طرف 200 ميكروليتر وإرفاقه المحقنة. ملء المحاقن مع حوالي 1 مل من الشحوم السيليكون. يتم تطبيق خيطا رفيعا من السيليكون على حواف الزجاج التي تغطي القيح بلطفهينج المكبس من المحاقن. الآن لديك غرفة صغيرة من النمو س. pombe الخلايا.
3. المجهري
- Initialise في مضان المجهري عن طريق تشغيل مصباح الزئبق / زينون ، المجهر والكمبيوتر. مكان الغرفة نمو الخميرة في مضان المجهر. استخدام هدفا X 63 X أو الهدف 100 مع NA = 1.3 أو أعلى. إذا كان يستخدم هدفا للنفط ، إضافة النفط.
- استخدام الحقل مشرق للعثور على الخلايا والحصول على صورة حادة.
- إعدادات المجهري مضان تختلف تبعا لfluorochromes تستخدم لتسمية خلايا الخميرة والمجهر. نستخدم مبائر مجهر زايس LSM مجهر المسح الضوئي ليزر 700 مع خطة لامزيغ - 63x النفط عدسة الهدف (NA = 1.4) مع خط المتوسط 16 طائرة إعداد المسح الضوئي. يجب تعيين وحدات ذات الثقب إلى 1-1،1 إيري ، الذي يعطي شريحة بصرية من 0.8 ملم. اكتشفنا GFP في المسار 1 باستخدام مجموعة تصفية اليكسا 488 مع التقسيم في شعاع 582 نانومتر ، وبذلك دetecting موجات بين 488 و 582 نانومتر. في المسار 2 نستخدم مجموعة التصفية المثلى لmCherry باستخدام الحزمة الخائن في 578 نانومتر ، وبالتالي الكشف عن الموجات بين 578 و 600 نانومتر. هذا يعني أنه في المسار 2 وسيتم الكشف عن كل من mRFP (SPB) ، وشمال البحر الأبيض المتوسط (mCherry).
- كما أخذ العديد من الصور اللازمة لتكون قادرة على قياس في 60 الخلايا مختلفة عن كل سلالة. عادة 15 صورة من حقول المجهري مستقلة بما فيه الكفاية. فمن المستحسن أن يتم تكوين غرفة جديدة للنمو مع خلايا جديدة اذا وقتك المجهري يتجاوز 60 دقيقة.
4. الكمية قياس المسافات التحت خلوية
- فتح الصور في برنامج زن زايس الطبعة الخفيفة. باستخدام أداة قياس المسافة في القياسات بين ميكرومتر fluorochromes مختلفة في كافة الخلايا فيه جميع الاشارات في طائرة الوصل نفسه. ضبط شدة الضوء والتباين في تحديد مركز للإشارة الفلورسنت. يستخدم هذا البروتوكول المبسط اثنين فقط ج مختلفةوبالتالي olours SPB وشمال البحر الأبيض المتوسط هي في نفس القناة. هو خص بها SPB هيكلها جولة كبيرة في شمال البحر الأبيض المتوسط. نقل المسافات إلى ورقة المفكرة. قياس لا يقل عن 60 في الخلايا. ويمكن أيضا برامج أخرى مثل ImageJ يمكن استخدامها لقياس المسافة ، ولكن يفضل زايس زن الخفيفة بسبب قرار العالي ، من الصورة وسهولة للتكبير والتصغير باستخدام هذا البرنامج. والصور في شكل LSM افتتح في ImageJ يكون القناتين على رأس كل منهما الآخر. لجعل صورة مع كل القنوات ، وتقسيم لأول مرة دمج القناتين وبعد ذلك لهم. بعد ذلك يمكن أن تستخدم أداة سطر لقياس المسافات على النحو الموصوف أعلاه.
- قارن بين المسافات يعني أو الوسيط بين سلالات مختلفة التحت خلوية والعلاجات باستخدام البرنامج الإحصائي ، على سبيل المثال اختبار t أو اختبار مان ويتني مجموع رتبة ، على سبيل المثال باستخدام برنامج SigmaStat - 3.5. في كثير من الأحيان ليست البيانات الموزعة منذ عادة سيكون هناك اختيار للخلايا مع أقصرالمسافات بين الإشارات الفلورسنت منذ إشارات جميعا بحاجة إلى أن يكون في الطائرة نفسها إلى التنسيق يقاس. يمكن فقط لاختبار t يتم استخدامها عند البيانات لديها التوزيع العادي في حين أن مجموع رتبة اختبار مان ويتني يسمح للمقارنة بين مجموعات البيانات التي تفتقر إلى التوزيع العادي. في اختبار T - تقارن يعني اثنين من قواعد البيانات المختلفة أثناء وجوده في رتبة مجموع اختبار مان ويتني تتم مقارنة المتوسط.
5. ممثل النتائج
سلالة PJ1185 : (ح + + his7 : dis1placR -- GFP Chr1 [: : + ura4 hphMX6 lacO] natMX6 ura4 - D18 leu1 - 32 - DN ade6 / N - sid4 mRFP : : : kanMX6 cut11 - mCherry :) كانت تزرع في EMM . تم سحب عينة والذي أقيم في غرفة صغيرة النمو ، وأخذت الصور (الشكل 1A + N). بعد ذلك تم استبدال وسائط النمو مع EMM ث / س ammoniumchloride (EMM - N) ، وكانت الخلايا زrown لمدة 15 دقيقة في حين تهتز. وقد شنت بعد ذلك تجويع الخلايا النيتروجين في غرفة النمو مع EMM - N والصور أخذت (الشكل 1A - N). تم استخدام أداة قياس لقياس المسافة بين موضع (GFP) وSPB في (الشكل 1B والجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس المسافة بين موضع (GFP) وشمال البحر الأبيض المتوسط (1B الشكل والجدول 2). وتمت مقارنة المسافات التحت خلوية وسيطة قبل وبعد استنزاف النيتروجين باستخدام 3.5 SigmaStat البرمجيات (الجدول 3). كان هناك تحول كبير إحصائيا في توطين الكتلة الجين تتحرك بعيدا عن شمال البحر الأبيض المتوسط نحو SBP. كانت بيانات قياس المسافة بين GFP وSBP في التوزيع العادي ، وبالتالي يعني مسافات (1،777 ميكرومتر + N و1587 ميكرومتر - N) ويمكن مقارنة باستخدام اختبار t (الجدول رقم 1 و 3). كان هناك فرق كبير بين القيمتين يعني (P = 0.008 ، اختبار t). فإن البيانات قياس المسافة بين GFP وشمال البحر الأبيض المتوسط لم يكن لديك دي العاديوتمت مقارنة stribution وبالتالي المسافات المتوسطة (0 ميكرون + N و 0.390 ميكرون - N) باستخدام مبلغ رتبة اختبار مان ويتني (الجدول 2 و 3). كان هناك فرق كبير بين القيمتين وسيطة (P <0.001 ، المجموع رتبة مان ويتني الاختبار).
الشكل 1 ، وتوطين مجموعة من الجينات المسماة Chr1 ، التي تميزت GFP ، تغيرت بعد المجاعة النيتروجين. (أ) العمود الأيسر ، + N ، وهو ممثل نواة الخلية من خلية تزرع في العمود الأيمن EMM ، - N ، وهو ممثل نواة الخلية من خلية تزرع في EMM - N. الأخضر هو إشارة GFP العلامات الكتلة Chr1 ، الأحمر هو mRFP mCherry ووصفها SPB وشمال البحر الأبيض المتوسط ، على التوالي. (ب) نواة الخلية نفس (A) ولكن الآن مع قياس المسافات subnuclear ؛ الصفراء : قطر نواة الخلية ، الزرقاء : المسافة بين SPB وإشارة GFP والوردي : المسافة بين إشارة GFP والغشاء النووي.
الجدول 1 ، وقياس المسافات في subnuclear ميكرون من سلالة PJ1185 تزرع في EMM. أول صف ، وقطره من الخلية (د) ، الصف الثاني ، وبعد المسافة بين GFP وSPB ، والصف الثالث ، وبعد المسافة بين GFP وشمال البحر الأبيض المتوسط.
الجدول 2. قياس المسافات في subnuclear ميكرون من سلالة PJ1185 تزرع في EMM - N. أول صف ، وقطره من الخلية (د) ، الصف الثاني ، وبعد المسافة بين GFP وSPB ، والصف الثالث ، وبعد المسافة بين GFP وشمال البحر الأبيض المتوسط.
Discussion
خلال العقد الماضي أصبح استخدام التصوير الخلية الحية لرصد الأحداث الخليوي شعبية متزايدة. بدأ ذلك مع استخدام البروتين الإسفار الأخضر من قنديل البحر Aequorea فيكتوريا والآن fluorochromes مختلفة كثيرة متاحة مضان ينبعث منها من خلال أطياف واسعة من السماوي (475 نانومتر) إلى اللون الأحمر حتى الآن (648 نانومتر) 11. واحد من أهم مزايا التصوير الخلية الحية عبر المناعي هو أنه لم يتم إصلاح الخلايا الفورمالديهايد أو المعاملة الايثانول / الأسيتون قبل المجهري ، وبالتالي تجنب القطع الممكنة من عملية التثبيت. بالإضافة إلى ذلك ، يعيش التصوير الخلية توفر إمكانية تتبع الخلايا الفردية ، والتقاط الصور على فترات متكررة خلال ساعات أو أيام من الحضانة ، مما يجعل من الممكن الحصول على الأفلام من الأحداث الخلوية 12. خلايا الثدييات لديها ميزة وجود حجم أكبر ، ويبلغ قطرها حوالي 100 ميكرون ، بالمقارنة مع خلايا الخميرة الصغيرة التي يبلغ قطرها حوالي 3-4 ومو ؛ متر. من ناحية أخرى ، فإن الميزة مع الخميرة الجينوم هو التلاعب بسهولة. مثلي تأشب يحدث بكفاءة عالية في الخميرة ، ويستخدم لفتيل البروتينات التي تهم مختلف fluorochromes 3. وعلاوة على ذلك ، وذلك باستخدام التكامل المستهدف لمتواليات lacO والتعبير لاحقة من البروتين GFP - LacR يسمح للكشف عن جزء معين من الجينوم داخل نواة الخلية 2. باستخدام S. خلايا pombe في المجهر ومزايا إضافية لأنها كائنات وحيدة الخلية الطبيعية التي تنمو مع الوقت جيل السريع في الظروف منخفضة التكلفة ثقافة الخلية. وعلاوة على ذلك ، S. pombe ممتازة الكائنات حقيقية النواة نموذج له منذ metazoan الجينات المتماثلة.
واحدة من القيود الرئيسية لهذا الأسلوب هو تألق ذاتي في خلية الخميرة مزعجة للكشف عن إشارة حقيقية. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام وسائط النمو مع الحد الأدنى من الجلوكوز تعقيم تصفية بدلا من تعقيمها. فيبالإضافة إلى ذلك ينبغي أن تزرع في خلايا الخميرة لمدة 2 يوما في المرحلة قبل التركيب سجل لهم. بروتوكول المعروضة هنا يقدم طريقة بسيطة نسبيا ، ولكن حتى الآن لتحديد الكمية توطين التحت خلوية من البروتينات داخل الخلية الخميرة. وعلاوة على ذلك عن طريق التقاط الصور عند نقاط زمنية مختلفة يمكننا متابعة الأحداث الخلوية.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نشكر الأستاذ هيراوكا لارسال لنا السلالات. نعترف بدعم من مؤسسة Gustafssons غوران وجمعية السرطان سويدية (2008/939).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L1395 | |
| Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Carl Zeiss, Inc. | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
| SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |
References
- Chalfie, M. fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-802 (1994).
- Robinett, C. C. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).
- Bahler, J. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14, 943-943 (1998).
- Asakawa, H., Hiraoka, Y. Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe. Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).
- Alfredsson-Timmins, J. Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 118, 99-99 (2009).
- Kristell, C. Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes. Genome. Res. 20, 361-361 (2010).
- West, R. R. cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).
- Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network. Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).
- Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).
- Soto, T. Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).
- Hagan, I. M., Ayscough, K. R. Fluorescence microscopy in yeast. Allan, V. J. , University Press. Oxford. (2000).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).
- Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection. J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).
