Summary
Den fissionsjäst,
Abstract
Flera mikroskopi tekniker som finns idag som kan påvisa ett specifikt protein i cellen. Under det senaste decenniet levande cell imaging med fluorokromer som Green Fluorescent Protein (GFP) direkt knuten till proteinet av intresse har blivit allt populärare 1. Använda GFP och liknande fluorokromer de subcellulära lokaliseringar och rörelser av proteiner kan upptäckas i ett fluorescerande mikroskop. Dessutom också subnuclear lokalisering av en viss region i en kromosom kan studeras med denna teknik. GFP är smält till Lac repressor protein (LacR) och ectopically uttrycks i cellen där tandem repeats av Laco sekvensen har satts in i regionen av intresse på kromosom 2. Den LacR-GFP kommer binda till Laco upprepas och att område av genomet kommer att vara synlig som en grön prick i fluorescensmikroskop. Jäst är speciellt lämpad för denna typ av manipulation eftersom homologrekombination är mycket effektiv och därmed möjliggör målinriktad integration av Laco upprepar och konstruerade proteiner fusion med GFP 3. Här beskriver vi en kvantitativ metod för levande cell analys av fissionsjäst. Ytterligare protokoll för levande cell analys av fissionsjäst finns, till exempel om hur man gör en film av meiotiska kromosomala beteende 4. I det här experimentet fokuserar vi på subnuclear organisation och hur det påverkas under genen induktion. Vi har märkt en gen kluster, döpt Chr1, genom införandet av Laco bindningsställen i närheten av de gener. Genen klustret är berikat för gener som induceras tidigt under kväve svält av fissionsjäst 5. I den stam cellens membran (NM) är märkt med tillägg av mCherry till NM proteinet Cut11 ger upphov till en röd fluorescerande signal. Spindeln Pole kroppen (SPB) förening Sid4 är smält till Red fluorescerande protein (Sid4-mRFP) 6 7. Den SPB identifieras som en stor rund struktur i NM. Genom avbildning före och 20 minuter efter utarmning av kväve källan kan vi bestämma avståndet mellan genen klustret (GFP) och NM / SPB. Den medel-eller medianvärden sträckor före och efter kväve utarmning jämförs och vi kan därmed kvantifiera huruvida det finns en förskjutning i subcellulära lokalisering av genen kluster efter kväve utarmning.
Protocol
1. Fissionsjäst kultur
- Förbered Edinburgh Minimal Media (EMM) och EMM utan ammoniumchloride (EMM-N) 8. För att minska autofluorescens glukoslösningen inte skall autoklaveras utan filter steriliseras med en 0,2 ìm filter och därefter läggs till autoklaveras media.
- Inokulera fissionsjäst celler som odlas friskt på en agarplatta med rik media, ja 8, i 3 ml EMM flytande medier med filter steriliserat glukos. Använd 13ml rör med en lätt skjuts på locket för att säkerställa god ventilation av cellerna. Låt cellerna växer genom att skaka dem med 225 rpm i 30 ° C. Håll cellerna växer i loggen fas (1 X 10 6 - 2 x 10 7 celler / ml) under 2 dagar genom att räkna dem med en Burker kammare följt av lämplig utspädning varje morgon och kväll.
- På dagen för experimentet se till att få cellerna i början log fas, 5 X 10 6 - 1 x 10 7 celler / ml.
- Att svälta tHan celler för kväve under 20 minuter gå från EMM media till EMM-N media. Detta görs genom att skörda 3 ml celler i ett 1,5 ml Eppendorf-rör i en bänk centrifugera vid max 1,5 RCF som centrifugering i en snabbare hastighet kan inducera en stressreaktion i fissionsjäst 9. Använd dubbla spinning tekniken, vilket innebär, först snurra i 2 min, vrid sedan Eppendorf-rör 180 ° och snurra igen för 1,5 RCF 2 min 10. Detta bidrar till att samla alla celler i en pellet på botten av röret. Tvätta en gång med EMM-N och sedan lös pelleten i EMM-N och inkubera celler i 15 minuter vid 30 ° C skaka vid 225 rpm och sedan fortsätta till punkt 2. Provberedning.
2. Provberedning
- Harvest 1,5 mL av celler i ett 1,5 ml Eppendorf-rör i en bänk centrifugera vid max 1,5 RCF som centrifugering i en snabbare hastighet kan inducera en stressreaktion i fissionsjäst 9. Använd dubbla spinning teknik, meaning, först snurra i 2 min, vrid sedan Eppendorf-rör 180 ° och snurra igen för 1,5 RCF i 2 min 10. Detta bidrar till att samla alla celler i en pellet på botten av röret.
- Avlägsna supernatanten, men lämna 10-15 mikroliter och återsuspendera cellerna i de återstående media. Alternativt lägga till 10 mikroliter av färsk media att resuspendera cellpelleten.
- Se till att ha klart glas diabilder och skyddsglas (Nej 1,5). Normalt behöver du inte rengöra dem, men se till att de inte är fulla av damm.
- Ta ut ur frysen en alikvot av en stamlösning av 1mg/ml lektin som har filter steriliseras. Den lektin Lösningen kan frysas om några gånger. Den lektin används för att fixera jästceller på täckglaset.
- Plats 5 mikroliter av EMM med filter steriliserat glukos på målet glaset.
- Plats 5 mikroliter av lektin lösning i hörnet av omslaget glas. Därefter plats 5 mikroliter av cellodling i samma hörn, det vill säga i lektin drop. Blanda genom att pipettera några gånger och sedan sprida cellodling-lektin mix hela locket glaset med den långa sidan av pipettspetsen. Beroende på täthet av din cell blandningen lämna allt eller suga upp överflödig vätska i motsatt hörn av omslaget glas.
- Placera skyddsglas, fyll på med en sida om målet glaset och den andra sidan på bänken. Låt locket glaset torka lite i några minuter. Det ska absolut inte vara helt torr, men det bör inte vara för mycket vätska på glaset.
- Placera locket glas med en ungefärlig 70 ° ängel från det mål glaset vid fall av EMM. Släpp täckglaset så att den faller uppifrån och ned i den droppe EMM.
- Att försegla kanterna med fett förbereda en 2 ml spruta. Skär den breda änden av en 200 l spets och fäst den på sprutan. Fyll sprutan med ca 1 ml av kisel fett. En fin linje av kisel appliceras på kanterna på täckglaset genom att försiktigt pusHing kolven på sprutan. Nu har du en liten ökning kammare S. pombe celler.
3. Mikroskopi
- Initiera fluorescensmikroskopi genom att vrida på kvicksilver / xenon lampa, mikroskop och datorn. Placera kammaren jäst tillväxt i fluorescensmikroskop. Använd en 63 x mål eller ett 100 X Målet med NA = 1,3 eller högre. Om en olja objektiv används, tillsätt olja.
- Använd den ljusa fältet för att hitta de celler och få en skarp bild.
- Inställningarna för fluorescensmikroskopi variera beroende på vilken fluorokromer används för att märka jästceller och mikroskopet. Vi använder en konfokalmikroskop Zeiss LSM 700 laserscanning Mikroskop med Plan-Apochromat 63x olja objektiv (NA = 1,4) med 16-linjen mittplanet skanningsinställning. Den Pinhole bör sättas till 1-1,1 Luftig enheter, vilket ger en optisk skiva 0,8 mm. Vi upptäcker GFP i spår 1 att använda filtret som för Alexa 488 med en stråldelare vid 582 nm, vilket detecting våglängder mellan 488 och 582 nm. I Spår 2 använder vi oss av ett filter som optimal för mCherry med en stråldelare vid 578 nm, och därmed upptäcka våglängder mellan 578 och 600 nm. Detta innebär att spår 2 kommer både mRFP (SPB) och NM (mCherry) kan upptäckas.
- Ta så många bilder som krävs för att kunna mäta i 60 olika celler för varje stam. Vanligtvis 15 bilder av oberoende mikroskopi fält är tillräckligt. Det rekommenderas att en ny tillväxt kammare med färska celler görs om din mikroskopi tid överstiger 60 minuter.
4. Kvantitativ mätning av subcellulära avstånd
- Öppna bilderna i Zeiss Zen Light Edition-programmet. Med hjälp av mätningarna verktyget mäta avståndet i ìm mellan de olika fluorokromer i alla de celler där alla signaler är i samma fokalplanet. Justera ljusstyrkan och kontrast för att identifiera mitten av fluorescerande signal. Det förenklade protokollet använder endast två olika Colours och därmed SPB och NM är i samma kanal. Den SPB pekas ut av dess stora runda struktur i NM. Överför avstånden till ett anteckningsblock ark. Mät i minst 60 celler. Andra program som ImageJ skulle också kunna användas för att mäta avstånd, men Zeiss Zen ljus är att föredra på grund av dess högre upplösning av bilden och lätt att zooma in och ut med det programmet. Bilder i LSM-format öppnas i ImageJ kommer att ha två kanaler ovanpå varandra. För att göra en bild med två kanaler, först dela upp de två kanalerna och därefter slå samman dem. Därefter linjen verktyg kan användas för att mäta avstånden enligt ovan.
- Jämför medel-eller medianvärden subcellulära avstånd mellan olika stammar och behandlingar med hjälp av ett statistikprogram, till exempel t-test eller Mann-Whitney Rank Sum Test, till exempel genom att använda SigmaStat-3.5-programvaran. Ofta uppgifterna inte är normalfördelad eftersom det kommer att bli ett val för celler med kortareavstånd mellan fluorescerande signaler eftersom alla signaler måste vara i samma fokalplanet som ska mätas. Ett t-test kan endast användas när data har en normalfördelning, medan en Mann-Whitney Rank Sum Test man jämföra datamängder som saknar normalfördelning. I ett t-test medelvärdet av två olika uppgifter jämförs medan en Mann-Whitney Rank Sum Test medianen jämförs.
5. Representativa resultat
Strain PJ1185: (H + his7 +:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 Laco] sid4-mRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN / N) har odlats i EMM . Ett prov drogs tillbaka och monteras i en liten tillväxt kammare och bilderna togs (Figur 1A + N). Därefter tillväxten media ersattes med EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N) och celler grown i 15 minuter under omskakning. Kvävet svalt cellerna var då monterad i en tillväxt kammare med EMM-N och bilderna togs (bild 1A-N). Den mätverktyg användes för att mäta avståndet mellan locus (GFP) och SPB (Fig. 1B och tabell 1). Dessutom var avståndet mellan locus (GFP) och NM uppmätta (bild 1B och tabell 2). Medianvärdet subcellulära avstånd före och efter kväve utarmning jämfördes med SigmaStat-3.5-programvara (tabell 3). Det fanns en statistiskt signifikant förändring i lokalisering av genen kluster på väg bort från NM mot SBP. De uppgifter som mäter avståndet mellan GFP och SBP hade en normalfördelning och därmed den genomsnittliga avstånden (1,777 ìm + N och 1587 ìm-N) skulle kunna jämföras med hjälp av ett t-test (tabell 1 och 3). Det fanns en signifikant skillnad mellan de två medelvärdena (P = 0,008, t-test). De uppgifter som mäter avståndet mellan GFP och NM hade inte en normal distribution och därmed medianen avstånden (0 ìm + N och 0,390 ìm-N) jämfördes med ett Mann-Whitney testet Rank Sum (tabell 2 och 3). Det fanns en signifikant skillnad mellan de två medianvärden (P <0,001, Mann-Whitney Rank Sum test).
Figur 1. Lokaliseringen av ett kluster av gener som heter Chr1, präglad av GFP, ändras efter kväve svält. (A) Vänster kolumn, + N, en representant cellkärna från en cell odlas i EMM högra kolumnen,-N, en representant cellkärna från en cell odlas i EMM-N. Grönt är GFP signalen märkning av Chr1 klustret, är röd i mRFP och mCherry märkning av SPB och NM, respektive. (B) Samma cellkärnan som (A) men nu med uppmätta subnuclear avstånd, gul: diametern på den cellkärna, blå: avståndet mellan SPB och GFP signalen och rosa: avståndet mellan GFP signalen och det nukleära membranet.
Tabell 1. Den uppmätta subnuclear avstånd i ìm av PJ1185 stammen vuxit i EMM. Första raden, diameter i cellen (d), andra raden, avståndet mellan GFP och SPB, tredje raden, avståndet mellan GFP och NM.
Tabell 2. Den uppmätta subnuclear avstånd i ìm av PJ1185 stammen vuxit i EMM-N. Första raden, diameter i cellen (d), andra raden, avståndet mellan GFP och SPB, tredje raden, avståndet mellan GFP och NM.
Discussion
Under det senaste decenniet användning av levande cell imaging att övervaka cellulära händelser har blivit allt populärare. Det började med att använda grön fluorescens Protein från maneten Aequorea victoria och nu många olika fluorokromer finns avger fluorescens genom ett brett spektra av cyan (475 nm) till långt rött (648 nm) 11. En av de stora fördelarna med levande cell imaging över immunofluorescens är att cellerna inte fastställts av formaldehyd eller etanol / aceton behandling innan mikroskopi, därav undviker eventuella föremål från fixering processen. Dessutom erbjuder levande cell imaging möjlighet att följa enskilda celler och ta bilder med täta mellanrum under timmar eller dagar för inkubation, vilket gör det möjligt att få filmer av cellulära händelser 12. Däggdjursceller har fördelen av att ha en större storlek, med en diameter på cirka 100 ìm, jämfört med de mindre jäst cell med en diameter på ca 3-4 &mu, m. Å andra sidan är fördelen med jäst den lättmanipulerade genomet. Homolog rekombination förekommer mycket effektivt i jäst och används för säkring proteiner av intresse för olika fluorokromer 3. Dessutom, med hjälp av riktade åtgärder för integration av Laco sekvenser och efterföljande uttryck för LacR-GFP protein möjliggör upptäckten av en specifik del av genomet inom cellkärnan 2. Använda S. pombe celler i mikroskopi har ytterligare fördelar eftersom de är naturliga encelliga organismer som växer med en snabb generationstid i lågkostnadsländer villkor cellkultur. Dessutom, S. pombe är ett utmärkt eukaryot organism eftersom den har flercelliga homologa gener.
En av de stora begränsningarna i denna teknik är autofluorescens i jästen cellen störande att upptäcka den sanna signalen. Detta problem kan lösas genom att använda minimal tillväxt media med filter steriliserat glukos istället för att autoklaveras. IDessutom jästceller bör odlas i 2 dagar i loggen fas innan du monterar dem. Protokollet presenteras här erbjuder en relativt enkel, men ändå kvantitativ metod för att bestämma subcellulära lokalisering av proteiner i jäst cell. Dessutom genom att ta bilder vid olika tidpunkter kan vi följa cellulära händelser.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar professor Hiraoka för att skicka oss stammar. Vi erkänner stöd från Göran Gustafssons stiftelse och Svenska Cancerfonden (2008/939).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L1395 | |
| Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Carl Zeiss, Inc. | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
| SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |
References
- Chalfie, M. fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-802 (1994).
- Robinett, C. C. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).
- Bahler, J. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14, 943-943 (1998).
- Asakawa, H., Hiraoka, Y. Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe. Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).
- Alfredsson-Timmins, J. Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 118, 99-99 (2009).
- Kristell, C. Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes. Genome. Res. 20, 361-361 (2010).
- West, R. R. cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).
- Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network. Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).
- Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).
- Soto, T. Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).
- Hagan, I. M., Ayscough, K. R. Fluorescence microscopy in yeast. Allan, V. J. , University Press. Oxford. (2000).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).
- Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection. J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).
