Summary
Den fission gær,
Abstract
Flere mikroskopi teknikker er til rådighed i dag, der kan opdage et specifikt protein i cellen. I det sidste tiår lever cell imaging ved hjælp fluorokromer som Green Fluorescent Protein (GFP) er direkte knyttet til protein af interesse er blevet mere og mere populært 1. Ved hjælp af GFP og lignende fluorokromer den subcellulære localisations og bevægelser af proteiner kan spores i en fluorescerende mikroskop. Desuden også subnuclear lokalisering af en bestemt region i et kromosom kan studeres ved hjælp af denne teknik. GFP er smeltet til Lac repressor protein (LacR) og ectopically til udtryk i den celle, hvor tandem gentagelser af Laco sekvensen er blevet indsat i regionen interesse på kromosom 2. Den LacR-GFP vil binde sig til Laco gentager og dette område af genomet vil være synlig som en grøn prik i fluorescens mikroskop. Gær er specielt velegnet til denne form for manipulation siden homologerekombination er meget effektiv og dermed muliggør målrettet integration af Laco gentager og manipuleret fusion proteiner med GFP 3. Her beskriver vi en kvantitativ metode til live-celle analyse af fission gær. Yderligere protokoller for levende celler analyse af fission gær kan findes, for eksempel på hvordan man laver en film af den meiotic kromosom adfærd 4. I dette særlige eksperiment fokuserer vi på subnuclear organisation, og hvordan det påvirkes under gen induktion. Vi har mærket et gen klynge, som er opkaldt Chr1, ved indførelse af Laco bindingssteder i nærheden af generne. Genet klynge er beriget for gener, som induceres tidligt i løbet af kvælstof udsultning af fission gær 5. I stammen kernemembranen (NM) er mærket af udlæg i mCherry til NM protein Cut11 giver anledning til en rød fluorescerende signal. Det Spindel Pole kroppen (SPB) sammensatte Sid4 er sammensmeltet til Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6 7. De SPB er identificeret som en stor rund struktur i NM. Ved billedbehandling før og 20 minutter efter udtynding af kvælstof kilde vi kan bestemme afstanden mellem genet klynge (GFP) og NM / SPB. Den gennemsnitlige eller mediane afstande før og efter kvælstof nedbrydning sammenlignes, og vi kan dermed kvantificere, hvorvidt der er et skift i subcellulære lokalisering af genet klyngen efter kvælstof udtynding.
Protocol
1. Fission gærkultur
- Forbered Edinburgh Minimal Media (EMM) og EMM uden ammoniumchloride (EMM-N) 8. For at reducere autofluorescens de glucoseopløsning skal ikke autoklaveres, men i stedet filter steriliseres ved hjælp af et 0,2 μm filter og efterfølgende påfyldes autoklaveres medier.
- Podes fission gærceller frisk dyrket på en agar plade med rich media, ja 8, i 3 ml EMM flydende medier med filter steriliseret glukose. Brug 13ml rør med en let skubbet på øvre grænser for at sikre god ventilation af cellerne. Lad cellerne vokse ved at ryste dem med 225 rpm i 30 ° C. Hold cellerne vokser i loggen fase (1 X 10 6 - 2 X 10 7 celler / ml) i 2 dage ved at tælle dem med en Burker kammer efterfulgt af passende fortynding, hver morgen og aften.
- På dagen for eksperimentet sørg for at have celler i den tidlige log fase, 5 X 10 6 - 1 X 10 7 celler / ml.
- At sulte than celler for kvælstof i 20 minutter skifte fra EMM medier til EMM-N medier. Dette gøres ved at høste 3 ml af celler i et 1,5 ml eppendorfrør på en bænk top centrifugeres ved højst 1,5 RCF som centrifugering ved en hurtigere hastighed, kan måske få et stress respons i fission gær 9. Brug den dobbelte spinning teknik, hvilket betyder, første spin i 2 min, og derefter tænde for eppendorfrør 180 ° og spin igen for 1,5 RCF 2 min 10. Dette medvirker til at indsamle alle de celler i en pellet i bunden af røret. Vask gang med EMM-N og derefter opløses pellet i EMM-N og inkuber cellerne i 15 minutter ved 30 ° C ryster ved 225 rpm, og derefter fortsætte til punkt 2. Prøveforberedelse.
2. Prøveforberedelse
- Harvest 1,5 ml af celler i et 1,5 ml eppendorfrør på en bænk top centrifugeres ved højst 1,5 RCF som centrifugering ved en hurtigere hastighed, kan måske få et stress respons i fission gær 9. Brug den dobbelte spinning teknik, meaning; første spin i 2 min, og derefter tænde for eppendorfrør 180 ° og spin igen for 1,5 RCF i 2 min 10. Dette medvirker til at indsamle alle de celler i en pellet i bunden af røret.
- Fjern supernatanten, men lad 10-15 μL og udeluk cellerne i de øvrige medier. Alternativt kan der tilsættes 10 μL af frisk medier til resuspender cellepelleten.
- Sørg for at have klart glas dias og dække glas (ikke 1,5). Normalt vil du ikke behøver at rense dem, men sørg for de er ikke fulde af støv.
- Tag ud af fryseren en alikvot af en stamopløsning af 1mg/ml lektin, der er blevet filter steriliseret. Den lektin løsning kan genfryses et par gange. Det lektin bruges til at fastsætte de gærceller på dækslet glas.
- Placer 5 mikroliter af EMM med filter steriliseret glucose på målet glas.
- Placer 5 mikroliter af lektin løsning i hjørnet af dækslet glas. Efterfølgende sted 5 mikroliter af cellekultur i samme hjørne, dvs i lectin drop. Bland ved pipettering et par gange og derefter sprede den celle kultur-lektin mix hele dække glasset med den lange side af pipettespidsen. Afhængig af tætheden af din celle blanding forlade alt eller opsuge overskydende væske i det modsatte hjørne af dækslet glas.
- Placer dækslet glas, top op, med den ene side på målsætningen glas og den anden side på bænken. Lad dækslet glasset tørre lidt i et par minutter. Det bør absolut ikke være helt tørt, men det bør ikke være for meget væske på glasset.
- Placer dække glasset med en omtrentlig 70 ° engel fra det mål glasset ved dråbe EMM. Slip af dækslet glasset, så det vil falde oven ned i dråbe EMM.
- At forsegle kanterne med silicium fedt forberede en 2 ml sprøjte. Skær den brede ende af en 200 μl spids og sæt den på sprøjten. Fyld sprøjten med ca 1 mL af silicium fedt. En fin serie af silicium anvendes til kanten af dækslet glasset ved forsigtigt at pusHing stemplet af sprøjten. Nu har du en lille vækst kammer S. pombe celler.
3. Mikroskopi
- Initialisere fluorescens mikroskopi ved at tænde for kviksølv / Xenon lampe, mikroskopet og computeren. Placer gær vækst kammer i fluorescens mikroskop. Brug en 63 x mål eller en 100 X objektiv med NA = 1,3 eller højere. Hvis en olie målet er brugt, tilsættes olie.
- Brug lyse felt til at finde de celler og få et skarpt billede.
- Indstillingerne for fluorescensmikroskopi variere afhængigt af fluorokromer anvendes til mærkning af gærceller og mikroskop. Vi bruger en konfokal mikroskop Zeiss LSM 700 Laser Scanning Microscope med Plan-Apochromat 63x olie objektiv (NA = 1,4) med den 16-line gennemsnit fly scanningsindstilling. Pinhole skal sættes til 1-1,1 Airy enheder, hvilket giver en optisk skive på 0,8 mm. Vi registrerer GFP i Spor 1 ved hjælp af filteret indstillet til Alexa 488 med en stråledeler på 582 nm, og dermed detecting bølgelængder mellem 488 og 582 nm. I Track 2 bruger vi et filter sæt optimale for mCherry ved hjælp af en stråledeler på 578 nm, og dermed afsløre bølgelængder mellem 578 og 600 nm. Det betyder, at i Spor 2 vil både mRFP (SPB) og NM (mCherry) blive opdaget.
- Tag så mange billeder skulle være i stand til at måle i 60 forskellige celler for hver stamme. Normalt 15 billeder af uafhængige mikroskopi felter er nok. Det anbefales, at en ny vækst-kammer med friske celler er lavet, hvis din mikroskopi tid overstiger 60 minutter.
4. Kvantitativ måling af subcellulære afstande
- Åbn billederne i Zeiss Zen Light Edition-programmet. Ved hjælp af målingerne værktøjet måle afstanden i μm mellem de forskellige fluorokromer i alle de celler, hvor alle signaler er i samme fokusplanet. Juster lysstyrke og kontrast for at identificere centrum af det fluorescerende signal. Denne forenklede protokol kun bruger to forskellige Colours og dermed SPB og NM er i samme kanal. De SPB er fremhævet af dens store runde struktur i NM. Overfør afstande til en notesblok ark. Foranstaltning i mindst 60 celler. Andre programmer som ImageJ kunne også bruges til at måle afstand, men Zeiss Zen lys er at foretrække på grund af sin højere opløsning af billedet, og den lethed for at zoome ind og ud ved hjælp af dette program. Billeder i LSM-format åbnet i ImageJ vil have to kanaler oven på hinanden. For at gøre et billede med begge kanaler, først delt de to kanaler og derefter flette dem. Derefter den linje værktøjet kan bruges til at måle afstandene som beskrevet ovenfor.
- Sammenlign middelværdien eller medianen subcellulære afstande mellem forskellige stammer og behandlinger ved hjælp af et statistisk program, for eksempel t-test eller Mann-Whitney Rank Sum test, for eksempel ved hjælp af SigmaStat-3.5-software. Ofte data er ikke normalfordelt, da der vil være et udvalg for celler med kortereafstande mellem fluorescerende signaler, da alle de signaler, skal være i samme brændplanet skal måles. En t-test kan kun bruges, når data har en normalfordeling, mens en Mann-Whitney Rank Sum Test tillader sammenligning af datasæt, der mangler normalfordeling. I en t-test for gennemsnit af to forskellige datasæt sammenlignes mens den i et Mann-Whitney Rank Sum Test medianen sammenlignes.
5. Repræsentative resultater
Strain PJ1185: (h + his7 +:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 Laco] sid4-mRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN / N) blev dyrket i EMM . En prøve blev trukket tilbage og monteret i en lille vækst kammer og billeder blev taget (Fig. 1A + N). Efterfølgende væksten medierne blev erstattet med EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), og celler blev grown i 15 minutter, mens omrystning. Kvælstof udsultes cellerne blev derefter monteret i en vækst kammer med EMM-N og billeder blev taget (Fig. 1A-N). Måleværktøjet blev brugt til at måle afstanden mellem locus (GFP) og SPB (Fig. 1B og Tabel 1). Desuden var afstanden mellem de locus (GFP) og NM målte (Fig. 1B og Tabel 2). Den mediane subcellulære afstande før og efter kvælstof udtynding blev sammenlignet ved hjælp af SigmaStat-3.5 software (tabel 3). Der var en statistisk signifikant skift i lokaliseringen af genet klyngen bevæger sig væk fra NM mod SBP. De data, der måler afstanden mellem GFP og SBP havde en normal fordeling og dermed den gennemsnitlige afstande (1,777 μm + N og 1.587 μm-N) kan sammenlignes med en t-test (tabel 1 og 3). Der var en signifikant forskel mellem de to middelværdier (P = 0,008, t-test). De data, der måler afstanden mellem GFP og NM havde ikke en normal distribution og dermed median afstande (0 μm + N og 0,390 μm-N) blev sammenlignet ved hjælp af en Mann-Whitney Rank Sum test (Tabel 2 og 3). Der var en signifikant forskel mellem de to medianværdier (p <0,001, Mann-Whitney Rank Sum test).
Figur 1. Lokalisering af en klynge af gener ved navn Chr1, præget af GFP, ændret efter kvælstof sult. (A) Venstre kolonne, + N, en repræsentant cellekernen fra en celle dyrket i EMM højre kolonne,-N, en repræsentant cellekernen fra en celle dyrkes i EMM-N. Grøn er den GFP-signalet mærkning af Chr1 klynge, rød er den mRFP og mCherry mærkning SPB og NM, hhv. (B) Samme cellekernen som (A), men nu med målte subnuclear afstande, gule: diameteren af cellekernen, blå: afstanden mellem SPB og GFP signal og lyserøde: afstanden mellem den GFP signal og kernemembranen.
Tabel 1. De målte subnuclear afstande i μm af PJ1185 stamme dyrket i EMM. Første række, diameter af cellen (d), anden række, afstand mellem GFP og SPB, tredje række, afstand mellem GFP og NM.
Tabel 2. De målte subnuclear afstande i μm af PJ1185 stammen dyrkes i EMM-N. Første række, diameter af cellen (d), anden række, afstand mellem GFP og SPB, tredje række, afstand mellem GFP og NM.
Discussion
I løbet af det sidste årti brug af levende celler billeddannelse til at overvåge cellulære begivenheder er blevet stadig mere populært. Det startede med brugen af grøn fluorescens protein fra vandmænd Aequorea victoria, og nu mange forskellige fluorokromer er tilgængelige udsender fluorescens via et bredt spektre fra cyan (475 nm) til langt rødt (648 nm) 11. En af de store fordele ved live-cell imaging løbet immunfluorescens er, at cellerne ikke er fastsat af formaldehyd eller ethanol / acetone behandling før mikroskopi, og dermed undgå eventuelle genstande fra den fiksering processen. Derudover tilbyder live-cell imaging mulighed for at følge de enkelte celler og tage billeder med korte intervaller i løbet af timer eller dage inkubation, hvilket gør det muligt at få film af cellulære begivenheder 12. Pattedyrceller har den fordel, at have en større størrelse, med en diameter på omkring 100 mM, i forhold til de mindre gær celle med en diameter på omkring 3-4 &MU; m. På den anden side er fordelen med gær det nemt manipuleres genom. Homolog rekombination sker meget effektivt i gær og bruges til at fiksere proteiner af interesse for forskellige fluorokromer 3. Desuden bruger målrettet integration af Laco sekvenser og efterfølgende udtryk for LacR-GFP protein tillader påvisning af en bestemt del af genomet i cellekernen 2. Brug S. pombe celler i mikroskopi har yderligere fordele, da de er naturlige encellede organismer, der vokser med en hurtig generation gang i low-cost cellekultur betingelser. Desuden S. pombe er en fremragende eukaryote model organisme, da det har metazoan homologe gener.
En af de største begrænsninger ved denne teknik er autofluorescens i gærcellen foruroligende at opdage den sande signal. Dette problem kan løses ved hjælp af minimal vækst medier med filter steriliseret glukose i stedet for autoklaveres. IDesuden gærcellerne skal dyrkes i 2 dage i log fase, før de monteres. Den protokol, der præsenteres her tilbyder en relativt enkel, men alligevel kvantitativ metode til at bestemme subcellulære lokalisering af proteiner i gær celle. Desuden ved at tage billeder på forskellige tidspunkter vi kan følge cellulære begivenheder.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker professor Hiraoka for at sende os stammer. Vi anerkender støtte fra Goran Gustafssons Foundation og den svenske Cancer Society (2008/939).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L1395 | |
| Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Carl Zeiss, Inc. | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
| SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |
References
- Chalfie, M. fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-802 (1994).
- Robinett, C. C. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).
- Bahler, J. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14, 943-943 (1998).
- Asakawa, H., Hiraoka, Y. Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe. Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).
- Alfredsson-Timmins, J. Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 118, 99-99 (2009).
- Kristell, C. Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes. Genome. Res. 20, 361-361 (2010).
- West, R. R. cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).
- Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network. Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).
- Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).
- Soto, T. Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).
- Hagan, I. M., Ayscough, K. R. Fluorescence microscopy in yeast. Allan, V. J. , University Press. Oxford. (2000).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).
- Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection. J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).
