Summary
분열 효모,
Abstract
몇 가지 현미경 기술은 세포 내에서 특정 단백질을 감지할 수 오늘날 사용할 수 있습니다. 지난 10 년 동안 직접 관심의 단백질에 부착된 녹색 형광 단백질 (GFP) 같은 fluorochromes를 사용하여 라이브 세포 이미징은 1 점차 인기를 끌고있다. GFP 및 이와 유사한 fluorochromes 사용 단백질의 subcellular localisations과 움직임은 형광 현미경에서 검출 수 있습니다. 더욱이, 또한 염색체의 특정 지역의 subnuclear 지방화이 기술을 사용하여 공부하실 수 있습니다. GFP는 LAC 억제 단백질 (LacR)에 융합하고 ectopically lacO 시퀀스 협동 반복이 염색체 2의 관심 영역에 삽입되었습니다 셀에 표시됩니다. LacR - GFP는 lacO 반복과 염색체의 부분은 형광 현미경에 녹색 점이 표시로 볼 수에 바인딩합니다. 효모는 특히 동종 때문에 조작이 유형에 적합합니다재조합은 매우 효율적이고함으로써 lacO 반복 및 GFP 3 엔지니어링 융합 단백질의 대상으로 통합이 가능합니다. 여기 우리는 분열 효모의 라이브 세포 분석을위한 양적 방법을 설명합니다. 분열 효모의 라이브 세포 분석을위한 추가적인 프로토콜을 찾을 수 meiotic 염색체 행동 4 동영상을 만드는 방법에 대한 예를 들어. 이 특정 실험에서 우리는 subnuclear 조직에 어떻게 그것이 유전자 유도하는 동안 영향을받습니다 중점을두고 있습니다. 우리는 유전자의 주변에 lacO 바인딩 사이트의 소개에 의해 Chr1라는 유전자 클러스터를, 분류했습니다. 유전자 클러스터는 분열 효모 5 질소 결핍시 초기 유도 아르 유전자에 대한 풍부합니다. 변형에서 핵 막 (NM)이 빨간색 형광 신호 상승을주는 NM 단백질 Cut11에 mCherry의 첨부 파일에 의해 표시됩니다. 스핀들 장대 바디 (SPB) 화합물 Sid4은 빨간색 형광 단백질 (Sid4 - mRFP) 6 융합이다 7에 포함된 SPB에 붙어 있습니다. SPB는 NM에 큰 원형 구조로 식별됩니다. 전에 이미지 20 분으로 질소 소스의 고갈 이후 우리는 유전자 클러스터 (GFP)과 NM / SPB 사이의 거리를 확인할 수 있습니다. 질소 고갈 이전과 이후 평균 또는 평균 거리는 비교하고 있으며 따라서 질소 고갈 후 유전자 클러스터의 subcellular 지방화에 변화가 있는지 여부를 계량하실 수 있습니다.
Protocol
1. 분열 효모 문화
- 에딘버러 최소 미디어 (EMM)와 ammoniumchloride 않고 EMM (EMM - N) 8을 준비합니다. autofluorescence 줄이기 위해 포도당 솔루션은 autoclaved하지만 필터와 이후 autoclaved 미디어에 추가 0.2 μm의를 사용하여 소독하는 대신 필터를해서는 안됩니다.
- 접종 분열 효모 세포는 신선한 필터 소독 포도당과 EMM 액체 매체 3 ML에, 8 네, 리치 미디어와 한천 플레이트에서 성장. 가 가볍게 세포의 좋은 통풍을 위해 모자를 강요와 13mL 튜브를 사용하십시오. 세포가 30 225 RPM으로 그들을 흔들어하여 성장하자 ° C. 세포 (1 X 10월 6일부터 2일까지 X 10 7 세포 / ML) 로그 단계에서 성장을 유지 Burker 챔버를 사용하여 계산하여 2 일간 적절한 희석, 매일 아침과 저녁으로 따라갔다.
- 실험 당일 초기 기록 단계, 5 세포를 가지고 있는지 확인하십시오 X 10월 6일부터 1일까지 X 10 7 세포 / ML.
- T를 굶어EMM - N 미디어로 EMM 미디어에서 20 분 동안 질소 스위치에 대한 그 세포. 이것은 빠른 속도로 원심 분리로 최대 1.5 rcf에서 벤치 최고 원심 분리기에서 1.5 ML Eppendorf 튜브에 세포 3 ML을 수확하여 수행은 분열 효모 9 스트레스 반응을 유발 할 수도 있습니다. 이중 회전 기술, 의미를 사용, 2 분 첫번째 스핀을 다음 Eppendorf 튜브 180 ° 회전하고 1.5 rcf 2 분 10 다시 돌린다. 이것은 튜브의 아래쪽에 하나의 펠렛에있는 모든 세포를 수집하는 데 도움이됩니다. EMM - N으로 한번 씻어하고 EMM - N의 펠렛을 해산 30 15 분 동안 전지를 품어 ° C 225 rpm으로 흔들어 후 2 지점으로 진행합니다. 샘플 준비.
2. 샘플 준비
- 빠른 속도로 원심 분리로 최대 1.5 rcf에서 벤치 최고 원심 분리기에서 1.5 ML Eppendorf 튜브에 세포의 수확 1.5 ML은 분열 효모 9 스트레스 반응을 유발 할 수도 있습니다. 이중 회전 기술, meani를 사용하여NG, 2 분 첫번째 스핀은 다음 Eppendorf 튜브 180 ° 회전 2 분 10 1.5 rcf 다시 돌린다. 이것은 튜브의 아래쪽에 하나의 펠렛에있는 모든 세포를 수집하는 데 도움이됩니다.
- 뜨는을 제거하지만, 휴가 10-15 μL하고 나머지 미디어 세포를 resuspend. 또는 세포 펠렛을 resuspend 신선한 미디어 10 μL를 추가합니다.
- 투명 유리 슬라이드를하고 (없음 1.5) 유리를 커버해야합니다. 일반적으로 당신이 그들을 청소해야하지만, 그들은 먼지가 가득되지 확인하지 않습니다.
- 냉장고에서 나온 필터 소독되었습니다 1mg/mL 렉틴의 재고 솔루션 나누어지는를 가져가라. 렉틴과 솔루션은 몇 번 refrozen 수 있습니다. 렉틴과은 커버 유리에있는 효모 세포를 수정하는 데 사용됩니다.
- 객관적인 유리에 필터 소독 포도당과 EMM의 장소 5 μL.
- 커버 유리의 모서리에 렉틴 솔루션 5 μL를 놓습니다. 이후 렉틴과 드롭 즉, 같은 모서리에있는 세포 배양의 5 μL를 배치. 다음 몇 번 pipetting하여 혼합하여 피펫 팁의 긴 쪽을 사용하여 덮개 유리를 통해 문화 렉틴 혼합 세포를 확산. 모든것을 떠나거나 커버 유리의 반대 모서리에 초과하는 액체를 빨아 휴대 혼합물의 밀도에 따라 다릅니다.
- 벤치에 목적 유리와 반대쪽에 한쪽으로 커버 유리, 꼭대기를 놓으십시오. 커버 유리가 몇 분 동안 약간 건조 보자. 그것은 절대적으로 완전히 건조하지 않아야하지만, 그것은 유리에 너무 많은 액체해서는 안됩니다.
- EMM의 드롭에 의한 객관적인 유리에서 약 70 ° 천사와 덮개 유리를 놓습니다. 그것이 EMM의 드롭 다운로 가기 떨어질 수 있도록 커버 유리 가자.
- 실리콘 그리스와 가장자리를 밀봉하기 위해서는 2 ML의 주사기를 준비합니다. 200 μl 팁의 넓은 끝을 잘라 주사기에 첨부해 주시기 바랍니다. 실리콘 기름의 약 1 ML로 주사기를 채우십시오. 실리콘의 벌금 라인이 부드럽게 고름으로 커버 유리의 가장자리에 적용됩니다주사기의 피스톤 hing. 이제 S.의 작은 성장 챔버를 pombe 세포.
3. 현미경 사용법
- 수은 / 크세논 램프, 현미경 및 컴퓨터 켜기하여 형광 현미경을 초기화. 형광 현미경에있는 효모 성장 챔버를 놓습니다. 63 X 목표 또는 = 1.3 이상 NA와 100 X 목표를 사용하십시오. 석유 목표가를 사용하는 경우, 오일을 추가합니다.
- 세포를 찾아 날카로운 사진을 얻을 수있는 밝은 필드를 사용합니다.
- 형광 현미경에 대한 설정은 효모 세포와 현미경 레이블을하는 데 사용되는 fluorochromes에 따라 다릅니다. 우리는 16 라인 평균 평면 스캔 설정 계획 - 고차 색지움 63x 오일 객관적인 렌즈 (NA는 = 1.4)와 공촛점 현미경 자이스 혈구 LSM 700 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다. 핀홀은 0.8 mm의 광학 슬라이스를 제공 1-1.1 공기 단위로 설정해야합니다. 우리는 따라서 D 582 NM에서 빔 스플리터와 알렉사 488에 대한 필터 설정을 사용하여 트랙 1에 GFP를 감지488과 582 nm의 파장 사이를 etecting. 트랙 2 우리는 따라서 578, 600 nm의 파장 사이를 감지, 578 nm의에서 빔 스플리터를 사용하여 mCherry 최적 필터 설정을 사용합니다. 이것은 트랙 2 mRFP (SPB)과 NM (mCherry) 모두가 감지된다는 것을 의미합니다.
- 많은 사진이 각 변형에 대해 60 종류의 세포의 측정을 할 수있는 능력이 필요로 가져가라. 보통 독립 현미경 분야의 15 사진은 충분히 있습니다. 이것은 귀하의 현미경 시간 60 분 초과하면 새로운 세포로 새 성장 챔버가 만든 것을 권장합니다.
4. subcellular 거리의 양적 측정
- 자이스 혈구 선종 라이트 버전 프로그램에서 사진을 엽니다. 측정 도구 측정 모든 신호가 같은 초점 평면에있는 모든 세포에서 다른 fluorochromes 사이 μm의에서 거리를 사용합니다. 형광 신호의 중심을 식별하는 빛의 강도와 대비를 조정합니다. 이 단순화된 프로토콜은 두 가지 C를 사용하여olours하고 따라서 SPB와 NM 같은 채널에 있습니다. SPB는 NM에서의 대형 원형 구조에 의해 선발되어집니다. 메모장 시트 거리를 전송합니다. 최소 60 세포에서 측정합니다. 같은 ImageJ 같은 다른 프로그램도 거리를 측정하는 데 사용될 수 있지만 자이스 혈구 선종 라이트 인해 그 높은 사진의 해상도와 해당 프로그램을 사용 및 축소하기 위해 쉽게하기 좋습니다. ImageJ에서 열린 lsm 형식으로 사진은 서로의 상단에있는 두 개의 채널을 것입니다. 두 채널로 사진을 만들려면 먼저 두 채널을 분리 이후 그들을 병합합니다. 이후 라인 도구는 위에서 설명한대로 거리를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
- SigmaStat - 3.5 소프트웨어를 사용하여 예를 들어, 예를 들어 T - 테스트 또는 맨 - 휘트니 순위 합 시험, 통계 프로그램을 사용하여 다른 변종과 치료 사이의 의미 또는 평균 subcellular 거리를 비교합니다. 짧은과 세포에 대한 선택이있을 것이다 때문에 자주 데이터가 정상적으로 배포되지 않습니다모든 신호부터 형광 신호 사이의 거리가 측정되는 동일한 초점 평면에 있어야합니다. 맨 - 휘트니 순위 합 시험은 정규 분포를 부족 데이터 집합의 비교를 허용하면서 데이터가 정규 분포를했을 때 T - 테스트에서만 사용할 수 있습니다. 맨 - 휘트니 순위 합 시험의 평균을 비교하는 동안 T - 테스트에서는 두 개의 서로 다른 데이터 세트의 의미가 비교됩니다.
5. 대표 결과
스트레인 PJ1185 : (H + his7 + : : dis1placR - GFP Chr1 [: : ura4 + hphMX6 lacO] sid4 - mRFP : kanMX6 cut11 - mCherry : natMX6 ura4 - D18 leu1 - 32 ade6 - DN / N)은 EMM에서 재배되었다 . 샘플은 취소 및 소형 성장 챔버에 탑재 및 사진 (그림 1A + N) 찍은되었습니다. 이후 성장 미디어는 EMM W / O ammoniumchloride (EMM - N)로 교체하고, 전지는 g 있었어요떨고하면서 15 분 동안 rown. 질소 굶주린 세포는 다음 EMM - N 및 사진과 함께 성장 챔버에 탑재되었습니다 것은 (그림 1A - N) 촬영되었습니다. 측정 도구는 현장 (GFP)와 SPB (그림 1B와의 표 1) 사이의 거리를 측정하는 데 사용되었다. 또한, 현장 (GFP)과 NM 사이의 거리는 (그림 1B와 표 2) 측정했습니다. 질소 고갈 이전과 이후 평균 subcellular 거리는 SigmaStat - 3.5 소프트웨어 (표 3)를 사용하여 비교했다. 멀리 SBP 향해 NM에서 이동 유전자 클러스터의 로컬 리 제이션에 통계적으로 의미 변화가 발생했습니다. GFP와 SBP 사이의 거리를 측정 데이터는 t - 테스트 (표 1 및 3)를 사용하여 비교있을 따라서 정규 분포와 평균 거리를 (1.777 μm의 + N 및 1,587 μm의 - N)했다. 두 의미 값 (P = 0.008, T - 테스트) 사이에 상당한 차이가 발생했습니다. GFP와 NM 사이의 거리를 측정 데이터는 정상적인 디가 없었어요stribution하고 따라서 평균 거리 (0 μm의 + N 및 0.390 μm의 - N)은 맨 - 휘트니 순위 합계 검사 (표 2 및 3)을 사용하여 비교했다. 두 평균 값 (P <0.001, 맨 - 휘트니 순위 합계 테스트) 사이에 상당한 차이가 발생했습니다.
그림 1. GFP로 표시되어 Chr1라는 유전자의 클러스터의 로컬 리 제이션은, 질소 기아 후에 변경되었습니다. (A) 왼쪽 열에서, + N, EMM 오른쪽 열에 자란 세포, - N, EMM - N에서 자란 세포에서 대표 세포 핵에서 대표 세포 핵. 그린은 Chr1 클러스터를 라벨 GFP 신호이며, 빨간색은 mRFP과 mCherry가 각각 SPB 및 NM을 라벨입니다. (B) 같은 세포 핵으로 (A)하지만 지금은 측정 subnuclear 거리로, 노란색 : 세포 핵의 직경, 파란색 : SPB 및 GFP 신호와 핑크 사이의 거리 : GFP 신호와 핵 막 사이의 거리.
표 1. EMM의 성장 PJ1185 변형의 μm의 측정에 subnuclear 거리. 첫 번째 행, 셀 (D), 둘째 행, GFP와 SPB 사이의 거리, 셋째 행, GFP와 NM 사이의 거리의 직경.
표 2. EMM - N에서 자란 PJ1185 변형의 μm의 측정에 subnuclear 거리. 첫 번째 행, 셀 (D), 둘째 행, GFP와 SPB 사이의 거리, 셋째 행, GFP와 NM 사이의 거리의 직경.
Discussion
지난 10 년 동안 세포 이벤트를 모니터링하는 라이브 세포 이미징의 사용은 점점 더 인기를 끌고있다. 그것은 해파리 Aequorea 빅토리아에서 녹색 형광 단백질의 사용을 시작하여 지금은 다양한 fluorochromes 훨씬 빨간색 (648 NM) 11 청록색 (475 NM)에서 다양한 스펙트럼을 통해 발광 형광 사용할 수 있습니다. immunofluorescence 이상의 라이브 세포 이미징의 주요 장점 중 하나는 세포 따라서 고정 과정에서 가능한 공예품을 피하기 위해, 현미경 전에 포름 알데히드 또는 에탄올 / 아세톤 치료로 해결되지 않은 것입니다. 또한, 라이브 세포 이미징 개별 세포를 따라 세포 사건 12 영화를하는 것이 가능하게, 부화의 시간 또는 일 동안 잦은 간격으로 사진을 찍을 수있는 가능성을 제공합니다. 포유류의 세포는 약 3-4 &의 직경이 작은 효모 세포에 비해, 약 100 μm의 직경을 가진 더 큰 크기를 갖는 장점을 가지고뮤, M. 반면에, 효모와 장점은 쉽게 넘어가지 게놈이다. 상동 재조합은 효모에 아주 효과적으로 발생하고 다른 fluorochromes 3 관심 단백질을 융합하는 데 사용됩니다. 또한, lacO 시퀀스 및 LacR - GFP 단백질의 후속 표현 대상으로 통합을 사용하면 세포 핵이 내의 염색체의 특정 부분의 검색이 가능합니다. S.를 사용하여 그들은 저렴한 비용으로 세포 배양 조건에서 빠른 세대 시간 성장할 자연 단세포 유기체이기 때문에 현미경의 pombe 세포는 추가 이점이 있습니다. 또한, S. 그것이 metazoan 상동 유전자를 가지고 이후 pombe는 훌륭한 진핵세포 모델 생물이다.
이 기술의 주요 한계 중 하나는 진정한 신호의 감지를 방해 효모 세포에 autofluorescence 있습니다. 이 문제는 필터 소독 포도당과 최소 성장 미디어를 사용하는 대신 autoclaved에 의해 극복할 수 있습니다. 에또한 효모 세포는 그들을 장착하기 전에 로그 단계에서 2 일간 성장해야합니다. 여기에 제시 프로토콜은 효모 세포 내에서 단백질의 subcellular 지방화를 결정하는 비교적 간단하지만, 아직 양적 방법을 제공합니다. 또 다른 시간 지점에서 사진을 찍고으로 우리는 세포 이벤트를 추적할 수 있습니다.
Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 우리에게 종자를 보내주셔서 교수 히라 오카 주셔서 감사합니다. 우리는 고란 Gustafssons 재단과 스웨덴의 암 협회 (939분의 2,008)에서 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L1395 | |
| Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Carl Zeiss, Inc. | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
| SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |
References
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