Summary
Fisjonsprosessen gjær,
Abstract
Flere mikroskopi teknikker er tilgjengelige i dag som kan oppdage et bestemt protein i cellen. I løpet av det siste tiåret leve cell imaging bruker fluorochromes som Green Fluorescent Protein (GFP) direkte knyttet til protein av interesse har blitt stadig mer populært en. Ved hjelp av GFP og lignende fluorochromes den subcellular localisations og bevegelser av proteiner kan oppdages i et fluorescerende mikroskop. Videre også subnuclear lokalisering av et visst område av et kromosom kan studeres ved hjelp av denne teknikken. GFP er smeltet til Lac repressor protein (LacR) og ectopically uttrykt i cellen der tandem gjentar av Laco sekvensen har blitt satt inn i regionen av interesse på kromosom 2. Den LacR-GFP vil binde seg til Laco gjentar og at område av genomet vil være synlig som en grønn prikk i fluorescens mikroskop. Gjær er spesielt egnet for denne type manipulasjon siden homologerekombinasjon er meget effektiv og dermed muliggjør målrettet integrering av Laco gjentar og konstruert fusjon proteiner med GFP 3. Her beskriver vi en kvantitativ metode for levende celle analyse av fisjonsprodukter gjær. Tilleggsprotokoller for live celle analyse av fisjonsprodukter gjær kan bli funnet, for eksempel på hvordan å lage en film av meiotisk kromosomal oppførsel fire. I dette forsøket har vi fokus på subnuclear organisasjon og hvordan det påvirkes under genet induksjon. Vi har merket et gen klynge, oppkalt Chr1, ved innføringen av Laco bindingssteder i nærheten av gener. Genet klyngen er beriket for gener som er indusert tidlig under nitrogen utsulting av fisjon gjær 5. I den belastningen det kjernefysiske membran (NM) er merket med feste mCherry til NM protein Cut11 gir opphav til en rød fluorescerende signal. Den Spindel Pole kroppen (SPB) compound Sid4 er smeltet til Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6 7. Den SPB er identifisert som en stor rund struktur i NM. Ved bildebehandling før og 20 minutter etter nedbryting av nitrogen kilden kan vi bestemme avstanden mellom genet cluster (GFP) og NM / SPB. Gjennomsnittlig eller median avstander før og etter nitrogen uttømming sammenlignes, og vi kan dermed kvantifisere hvorvidt det er et skifte i subcellular lokalisering av genet klynge etter nitrogen utarming.
Protocol
1. Fisjon gjær kultur
- Forbered Edinburgh Minimal Media (EMM) og EMM uten ammoniumchloride (EMM-N) 8. For å redusere autofluorescence glukose løsningen ikke bør autoklaveres men i stedet filter steriliseres med et 0,2 mikrometer filter og deretter lagt til autoklaveres media.
- Inokulere fisjon gjærceller ferske dyrket på en agar plate med rike media, ja 8, i 3 mL EMM flytende medier med filter sterilisert glukose. Bruk 13ml rør med en lett presset på lokket for å sikre god ventilasjon av cellene. La cellene vokse ved å riste dem med 225 rpm i 30 ° C. Hold celler som vokser i log fase (1 x 10 6 - 2 x 10 7 celler / ml) for 2 dager ved å telle dem ved hjelp av en Burker kammer fulgt av passende fortynning, hver morgen og kveld.
- På dagen for forsøket sørg for å ha celler i tidlige log fase, 5 x 10 6 - 1 x 10 7 celler / ml.
- Å sulte tHan celler for nitrogen under 20 minutter bytte fra EMM media til EMM-N media. Dette gjøres ved å høste 3 ml av celler i en 1,5 mL Eppendorf rør i en benk topp sentrifuger ved maksimalt 1,5 RCF som sentrifugeres på en raskere hastighet kan indusere en stressrespons i fisjon gjær 9. Bruk den dobbeltsidige spinne teknikken, som betyr; første spin for 2 min, deretter snu Eppendorf tube 180 ° og spinne igjen for 1,5 RCF 2 min 10. Dette bidrar til å samle alle cellene i en pellet i bunnen av røret. Vask straks med EMM-N og deretter oppløse pellet i EMM-N og inkuber cellene i 15 minutter ved 30 ° C rist ved 225 rpm og deretter fortsette til punkt to. Prøveopparbeidelse.
2. Prøvepreparering
- Høste 1,5 mL av celler i et 1,5 ml Eppendorf rør i en benk topp sentrifuger ved maksimalt 1,5 RCF som sentrifugeres på en raskere hastighet kan indusere en stressrespons i fisjon gjær 9. Bruk doble roterende teknikk, meaning; første spin for 2 min, deretter snu Eppendorf tube 180 ° og spinne igjen for 1,5 RCF for 2 min 10. Dette bidrar til å samle alle cellene i en pellet i bunnen av røret.
- Fjern supernatanten, men la 10-15 mL og resuspender cellene i de resterende media. Alternativt kan du legge til 10 mL av fersk media til cellepelleten suspenderes.
- Sørg for å ha klare glass lysbilder og dekker glass (No 1,5). Normalt trenger du ikke å vaske dem, men pass på at de ikke er fulle av støv.
- Ta ut av fryseren en delmengde av en stamløsning av 1mg/mL lektin som har blitt filter sterilisert. Den lektin Løsningen kan fryses på nytt noen ganger. Den lektin brukes til å feste gjærceller på omslaget glass.
- Plasser 5 mL av EMM med filter sterilisert glukose på målet glass.
- Plasser 5 mL av lektin løsning i hjørnet på dekselet glass. Deretter plasserer 5 mL av cellekultur i samme hjørnet, dvs. i lektin slipp. Bland ved pipettering et par ganger og deretter spre cellekultur-lektin mix hele dekselet glass med den lange siden av pipettespissen. Avhengig av tettheten av celle blanding forlate alt eller suge opp overflødig væske i motsatt hjørne av dekselet glass.
- Plasser dekselet glass, topp opp med den ene siden av målet glass og den andre siden på benken. La dekselet glass tørr litt i noen minutter. Det bør absolutt ikke være helt tørt, men det bør ikke være for mye væske på glasset.
- Plasser lokket glass med en omtrentlig 70 ° engel fra den objektive glasset ved dråpe EMM. Slipp av dekselet glasset slik at det vil falle toppen ned i dråpe EMM.
- Å forsegle kantene med silikon fett forberede en 2 ml sprøyte. Skjær den brede enden av en 200 mL spissen og fest den til sprøyten. Fyll sprøyten med ca 1 mL av silisium fett. En fin linje av silisium er brukt på kantene av dekselet glass ved forsiktig pushengsle stempelet på sprøyten. Nå har du en liten vekst kammer S. pombe celler.
3. Mikroskopi
- Initialiserer fluorescens mikroskopi ved å slå på kvikksølv / xenon lampe, mikroskopet og datamaskinen. Plasser gjær vekst kammer i fluorescens mikroskop. Bruk en 63 x objektiv eller en 100 X objektiv med NA = 1.3 eller høyere. Hvis en olje objektiv er brukt, tilsett olje.
- Bruk lyse feltet for å finne cellene og få et skarpt bilde.
- Innstillingene for fluorescens mikroskopi varierer avhengig av fluorochromes brukes til å merke gjærceller og mikroskop. Vi bruker en confocal mikroskop Zeiss LSM 700 Laser Scanning Microscope med Plan-Apochromat 63x olje objektiv (NA = 1,4) med 16-linjen gjennomsnittlig planet scan setting. Den pinhole bør settes til 1 til 1,1 Airy enheter, som gir en optisk skive på 0,8 mm. Vi oppdager GFP i Spor 1 ved hjelp av filteret satt for Alexa 488 med en bjelke splitter på 582 nm, og dermed detecting bølgelengder mellom 488 og 582 nm. I Spor 2 bruker vi et filter satt optimal for mCherry hjelp av en bjelke splitter på 578 nm, og dermed oppdage bølgelengder mellom 578 og 600 nm. Dette betyr at i Spor 2 vil både mRFP (SPB) og NM (mCherry) bli oppdaget.
- Ta så mange bilder for å kunne måle i 60 forskjellige celler for hver stamme. Vanligvis 15 bilder av uavhengige mikroskopi felt er nok. Det anbefales at en ny vekst kammer med friske celler er gjort hvis mikroskopi tiden overstiger 60 minutter.
Fire. Kvantitativ måling av subcellular avstander
- Åpne bildene i Zeiss Zen Lys Edition program. Bruke målingene verktøy måle avstanden i mikrometer mellom de ulike fluorochromes i alle cellene hvor alle signalene er i samme fokalplanet. Juster lysintensitet og kontrast for å identifisere midten av fluorescerende signal. Denne forenklede protokollen bruker bare to forskjellige colours og dermed SPB og NM er i samme kanal. Den SPB er utpekt av sin store runde strukturen i NM. Overfør avstander til en notisblokk ark. Mål i minst 60 celler. Andre programmer som ImageJ kan også brukes til å måle avstand, men Zeiss Zen lys er å foretrekke på grunn av sin høyere oppløsning av bildet og enkelt å zoome inn og ut ved hjelp av det programmet. Bilder i LSM format åpnet i ImageJ vil ha to kanaler på toppen av hverandre. For å lage et bilde med begge kanaler, først splitte de to kanalene, og deretter flette dem. Deretter linjen verktøyet kan brukes til å måle avstander som beskrevet ovenfor.
- Sammenlign gjennomsnittlig eller median subcellular avstander mellom ulike stammer og behandlinger ved hjelp av en statistisk program, for eksempel t-test eller Mann-Whitney Rank Sum Test, for eksempel ved hjelp av SigmaStat-3.5-programvare. Ofte dataene ikke er normalfordelt siden det vil være et utvalg for celler med kortereavstander mellom den fluorescerende signaler siden alle signalene må være i samme fokusplanet som skal måles. En t-testen kan bare brukes når dataene har en normal fordeling mens en Mann-Whitney Rank Sum Test tillater sammenligning av datasett som mangler normal distribusjon. I en t-test middelverdien av to ulike datasett er sammenlignet mens i en Mann-Whitney Rank Sum Test Medianen er sammenlignet.
5. Representant Resultater
Strain PJ1185: (h + his7 +:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 Laco] sid4-mRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN / N) ble dyrket i EMM . Et utvalg ble trukket og montert i en liten vekst kammer og bildene ble tatt (Fig. 1A + N). Deretter vekstmedier ble erstattet med EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), og cellene ble grown i 15 minutter mens risting. Den nitrogen sultet cellene ble så montert i en vekst kammer med EMM-N og bildene ble tatt (Fig. 1A-N). Den måleverktøyet ble brukt til å måle avstanden mellom locus (GFP) og SPB (Fig. 1B og tabell 1). I tillegg var avstanden mellom locus (GFP) og NM måles (Fig. 1B og tabell 2). Median subcellular avstandene før og etter nitrogen uttømming ble sammenlignet med SigmaStat-3.5-programvare (Tabell 3). Det var en statistisk signifikant endring i lokalisering av genet cluster beveger seg bort fra NM mot SBP. Dataene måle avstanden mellom GFP og SBP hadde en normal fordeling og dermed gjennomsnittlig avstander (1,777 mikrometer + N og 1587 mikrometer-N) kan sammenlignes med en t-test (Tabell 1 og 3). Det var en signifikant forskjell mellom de to middelverdiene (P = 0,008, t-test). Dataene måle avstanden mellom GFP og NM har ikke hatt en normal distribution og dermed median avstander (0 mikrometer + N og 0.390 mikrometer-N) ble sammenlignet ved hjelp av en Mann-Whitney Rank Sum test (Tabell 2 og 3). Det var en signifikant forskjell mellom de to median verdier (P <0,001, Mann-Whitney Rank Sum test).
Figur 1. Lokalisering av en klynge av gener kalt Chr1, preget av GFP, endret etter nitrogen sult. (A) Venstre kolonne, + N, en representant cellekjernen fra en celle dyrket i EMM høyre kolonne,-N, en representant cellekjernen fra en celle dyrket i EMM-N. Grønn er den GFP signal merking av Chr1 klyngen, er rød i mRFP og mCherry merking av SPB og NM, henholdsvis. (B) Samme cellekjernen som (A), men nå med målte subnuclear avstander, gul: diameteren på cellekjernen, blå: avstanden mellom SPB og GFP signal og rosa: avstanden mellom GFP signalet og kjernefysiske membran.
Tabell 1. Den målte subnuclear avstander i mikrometer av PJ1185 belastningen dyrket i EMM. Første rad, diameter av cellen (d), andre rad, avstand mellom GFP og SPB, tredje rad, avstand mellom GFP og NM.
Tabell 2. Den målte subnuclear avstander i mikrometer av PJ1185 belastningen vokst i EMM-N. Første rad, diameter av cellen (d), andre rad, avstand mellom GFP og SPB, tredje rad, avstand mellom GFP og NM.
Discussion
I løpet av det siste tiåret bruk av levende celle bildebehandling til å overvåke cellulære hendelser har blitt stadig mer populært. Det startet med bruk av grønne Fluorescens Protein fra maneter Aequorea victoria og nå mange forskjellige fluorochromes finnes sender ut fluorescens gjennom et bredt spekter fra cyan (475 nm) til langt rødt (648 nm) 11. En av de store fordelene av levende celle avbildning enn immunfluorescens er at cellene ikke er fastsatt av formaldehyd eller etanol / aceton behandling før mikroskopi, dermed unngå mulige gjenstander fra fiksering prosessen. I tillegg tilbyr live cell imaging muligheten til å følge individuelle celler og ta bilder med jevne mellomrom i løpet av timer eller dager av inkubasjon gjør det mulig å få filmer av cellulære begivenheter 12. Mammalske celler har fordelen av å ha en større størrelse, med diameter på rundt 100 mikrometer, sammenlignet med mindre gjær celle med en diameter på ca 3-4 μ m. På den annen side er fordelen med gjær de lett manipuleres genomet. Homolog rekombinasjon forekommer svært effektivt i gjær og brukes til sikring proteiner av interesse for forskjellige fluorochromes 3. Videre bruker målrettet integrering av Laco sekvenser og påfølgende uttrykk for LacR-GFP protein tillater påvisning av en bestemt del av genomet i cellekjernen 2. Ved hjelp av S. pombe celler i mikroskopi har flere fordeler siden de er naturlige encellede organismer som vokser med en rask generasjonstid i lavkostland cellekultur forhold. Dessuten S. pombe er en utmerket eukaryote modell organisme siden det har metazoan homologe gener.
En av de store begrensningene i denne teknikken er autofluorescence i gjærcelle urovekkende påvisning av den sanne signalet. Dette problemet kan løses ved hjelp av minimal vekstmedier med filter sterilisert glukose istedenfor autoklaveres. Itillegg gjærceller bør dyrkes for 2 dager i log fase før de monteres. Protokollen som presenteres her har en relativt enkel, men likevel kvantitativ metode for å bestemme subcellular lokalisering av proteiner i gjærcelle. Videre ved å ta bilder på forskjellige tidspunkt kan vi følge cellulære begivenheter.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Professor Hiraoka for å sende oss stammer. Vi erkjenner støtte fra Goran Gustafssons Foundation og det svenske Cancer Society (2008/939).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L1395 | |
| Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Carl Zeiss, Inc. | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
| SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |
References
- Chalfie, M. fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-802 (1994).
- Robinett, C. C. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).
- Bahler, J. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14, 943-943 (1998).
- Asakawa, H., Hiraoka, Y. Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe. Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).
- Alfredsson-Timmins, J. Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 118, 99-99 (2009).
- Kristell, C. Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes. Genome. Res. 20, 361-361 (2010).
- West, R. R. cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).
- Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network. Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).
- Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).
- Soto, T. Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).
- Hagan, I. M., Ayscough, K. R. Fluorescence microscopy in yeast. Allan, V. J. , University Press. Oxford. (2000).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).
- Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection. J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).
