Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ونظام 3D لغضروفية التثقيف مفصلي الإنسان في السائل الزليلي

Published: January 31, 2012 doi: 10.3791/3587
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Anatomy and Cellular Biology, Tufts University School of Medicine, 2Department of Rheumatology, Tufts Medical Center

Summary

يوصف نظام 3D من غضروفية زراعة مفصلي الإنسان في مستويات عالية من السائل الزليلي. السائل الزليلي يعكس المكروية الطبيعية لمعظم الغضروف المفصلي ، ويمكن الحصول عليها بسهولة وتخزينها. هذا النظام بالتالي يمكن استخدامها لدراسة تجديد الغضاريف والتداوي الفرز لعلاج التهاب المفاصل.

Abstract

الغضروف التدمير هو سمة مركزية المرضية لالتهاب المفاصل ، وهو السبب الرئيسي للعجز في الولايات المتحدة. الغضروف في البالغين لا تتجدد بشكل فعال جدا في الجسم الحي ، ونتيجة لذلك ، يؤدي الى هشاشة العظام لا رجعة فيه فقدان الغضروف ويترافق الألم المزمن و1،2 الجمود. الغضروف هندسة الأنسجة إمكانات واعدة لتجديد واستعادة وظيفة الأنسجة. هذه التكنولوجيا عادة ما ينطوي على غضروفية البذر في السقالات الطبيعية أو الاصطناعية واستزراع 3D الناتجة بناء في وسط متوازن على مدى فترة من الزمن بهدف للهندسة الأنسجة كيميائيا وناضجة biomechanically التي يمكن زرعها في موقع الخلل في الجسم الحي 3-6 . تحقيق شرط الأمثل للنمو خلية غضروفية وترسب مصفوفة أمر ضروري لنجاح هندسة الأنسجة الغضروف.

في الغضروف الأصلي مشتركة ، تجويف في القطب الشماليواستحم سطح جزيئية من العظام في السائل الزليلي. هذا السائل اللزج واضحة وتوفر المواد المغذية إلى الغضروف المفصلي لاوعائي ويحتوي على عوامل النمو ، والسيتوكينات والأنزيمات التي تعتبر مهمة لعملية الأيض 7،8 خلية غضروفية. علاوة على ذلك ، السائل الزليلي يسهل حركة منخفضة الاحتكاك بين الأسطح الغضروفية أساسا من خلال إفراز عنصرين رئيسيين ، وhyaluronan lubricin 9 10. في المقابل ، غالبا ما يتم تربيتها الغضروف الأنسجة المهندسة في وسائل اصطناعية. في حين أن وسائل الإعلام هذه على الأرجح قادرة على توفير ظروف أكثر تحديدا لدراسة الأيض خلية غضروفية ، السائل الزليلي أدق تعكس البيئة الطبيعية التي تتواجد فيها غضروفية مفصلي

في الواقع ، السائل الزليلي لديها ميزة كونها سهلة للحصول على وتخزينها ، وكثيرا ما يمكن تجديدها بشكل منتظم من قبل الجسم. وقد استكملت عدة مجموعات في مستنبت مع السائل الزليلي في نمو الإنسان ، والأرانب والأبقار والكلاب جhondrocytes ، ولكنها تستخدم في الغالب سوى مستويات منخفضة من السائل الزليلي (أقل من 20 ٪) 11-25. في حين تم تربيتها الدجاج والخيول والإنسان غضروفية في المتوسط ​​مع ارتفاع نسبة السائل الزليلي ، وكانت هذه النظم ثقافة ثنائية الأبعاد 26-28. هنا نقدم أسلوبنا في غضروفية زراعة مفصلي الإنسان في نظام 3D مع نسبة عالية من السائل الزليلي (تصل إلى 100 ٪) خلال فترة 21 يوما. في القيام بذلك ، تغلبنا على عقبة رئيسية قدمها اللزوجة العالية من السائل الزليلي. هذا النظام يتيح إمكانية دراسة غضروفية الإنسان في السائل الزليلي في وضع 3D ، والتي يمكن دمجها مع عوامل أخرى الهامتين الأخرى (توتر الأوكسجين والتحميل الميكانيكية) 29،30 التي تشكل البيئة الطبيعية لغضروف لمحاكاة الوسط الطبيعي غضروف النمو. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن يستخدم هذا النظام لمعايرة السوائل على النشاط الزلالي غضروفية وتوفير منبر للتطويرالغضروف تجديد التقنيات والخيارات العلاجية لالتهاب المفاصل.

Protocol

نظام 3D لغضروفية زراعة مفصلي الإنسان في السائل الزليلي

في هذا العمل ، ونحن مغلفة غضروفية مفصلي الإنسان في الخرز باستخدام الجينات المعدلة صناعة التغليف ، واقترح البروتوكول (Lonza ، و 31). تستخدم هذه التركيبات 3D ، وقد وضعنا نظاما لزراعة الخلايا في مستنبت تحتوي على نسب مختلفة من السائل الزليلي الإنسان وقيم وثوابت هذه 3D للتعبير الجين الغضروف.

1. إعداد غضروفية مفصلي الإنسان (HAC) لتغليف (3D) ثلاثية الأبعاد

  1. ذوبان الجليد قارورة (1 مل) من غضروفية مفصلي الإنسان (HAC) (Lonza) (الممر 2) في 37 درجة مئوية لمدة حمام ماء 1 دقيقة.
  2. مع مزيج من وسائط النمو 1ml خلية غضروفية (Lonza) والطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3-5 دقيقة لجمع الخلايا. تجاهل طاف.
  3. بيليه Resuspend خلية خلية غضروفية النمو في وسائل الإعلام (Lonza).
  4. الخلايا في نسيج اللوحة 10 سملوحة الثقافة دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ، والثقافة في وسائل الإعلام نمو خلية غضروفية (Lonza) حتى الخلايا متموجة. متلازمة الطفل المفرط النشاط ينبغي أن تستخدم في عدد لا يزيد مرور 3 أو 4 (P3 أو P4).
  5. يغسل متلازمة الطفل المفرط النشاط على لوحة مع 155mM كلوريد الصوديوم بدلا من معيار PBS ، تليها trypsinzation لجمع الخلايا لتغليف ألجينات حبة. حالما يتم فصل الخلايا ، وتدور إلى أسفل الخلايا في 3000rpm ل5min. الخلايا هي الآن جاهزة للتغليف 3D.

2. متلازمة الطفل المفرط النشاط في تغليف حبات 3D

Resuspend ومتلازمة الطفل المفرط النشاط في حل ألجينات 1.2 ٪ (سيغما) في كثافة 8X10 5 خلية / مل. وتم تحديد أعداد الخلايا قبل التغليف ، وذلك باستخدام عداد الخلية القياسية. من المهم جدا أن يختلط جيدا لضمان توزيع عادل للخلايا في الخرز.

  1. ماصة للHAC / الجيني خليط المحلول إلى 12 مل حقنة المرفقة إبرة عيار 22 (تايكو الرعاية الصحية ، وشركة).
  2. وفي الوقت نفسه ، تعد الدورق 50 مل مع 102 مM CaCl 2 في حجم 5 مرات من الحل HAC / aginate. وضع قضيب تحريك داخل الدورق ويحرك 102 مم 2 CaCl حل ببطء (على ما يقرب من 150 دورة في الدقيقة).
  3. عقد قمة حقنة حوالي 6 بوصات فوق سطح الحل 2 CaCl وإضافة خليط HAC / الجينات في حل قطرة قطرة CaCl 2. بشكل عام ، والخرز ألجينات الناتجة 2mm وقطرها مع كثافة التغليف حوالي 10 4 خلية / حبة. ملاحظة : ارتفاع المحقنة خلال حل 2 CaCl هو المهم. وسوف أقصر مسافة نتيجة انخفاض المسيل للدموع في شكل بدلا من الخرز على شكل كروي ، مما تسبب في تفاوت السلامة الميكانيكية والتغليف الخلية.
  4. اسمحوا حبات ضجة في حل 2 CaCl عن 20-25 دقيقة. في حين أن غيرها بروتوكولات التغليف ألجينات تشير إلى وجود فترة حضانة أقصر بكثير من 10min ، وجدنا أن أطول فترة حضانة مع الحل 2 CaCl تعزيز سلامة أنالإعلانات.
  5. إزالة CaCl 2 الحل ، تغسل حبات 2-3 مرات في غضون 2-3 مجلدات من كلوريد الصوديوم ، ومن ثم مرة واحدة في المتوسط ​​تمايز خلية غضروفية (Lonza). في حين أن غيرها بروتوكولات ألجينات تغليف حبة تنطوي على استخدام عامل تصفية لغسل الإجراءات المذكورة أعلاه ، وجدنا أن حبات الجينات غالبا ما تصبح المحاصرين في تصفية خارج وجاف ، وبالتالي تقليل كفاءة التغليف. وجدنا أنه الأكثر كفاءة للسماح حبات ليستقر في قاع الكأس قبل رميه الحل.
  6. استخدام ملعقة القياسية لنقل الخرز إلى أطباق الثقافة. نحن ثقافة عادة 12 حبات في 3 سم جيدا لمدة 2 يوما في المتوسط ​​نمو خلية غضروفية غضروفية للسماح للتكيف مع عملية التغليف في الأجلين المتوسط ​​وتزرع في التحول إلى متوسطة قبل تمايز خلية غضروفية (Lonza) مع السائل الزليلي.

3. غضروفية الثقافة في السائل الزليلي مستنبت

  1. ويمكن الحصول على السائل الزليلي جديدة من سعيادة utpatient (حصلنا السائل الزليلي من المركز الطبي لجامعة تافتس). ويمكن نقل السائل الزليلي في أنابيب الصقر 15ml إلى المختبر ، وطرد على الفور في 3000 دورة في الدقيقة لإزالة الحطام 15min الخلية. قسامة خالية من الخلايا في السائل الزليلي 1.5 أنابيب microcentrifuge مل ، لتجنب تكرار تجميد الذوبان. ويمكن تخزين طاف على -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. قبل زراعة ، مزيج السائل الزليلي المتوسطة مع تمايز خلية غضروفية (آلية التنمية النظيفة ، Lonza) في نسب متفاوتة الحجمي ، مع التركيز المستمر من حامض الاسكوربيك و100mM 9 ملم CaCl 2 (هذا المبلغ اثر CaCl 2 هو لضمان سلامة الجينات الخرز).
  3. الحفاظ على لوحة على منصة هزاز في الحاضنة 37 درجة مئوية (تردد الهزاز : حوالي 75 مرة / دقيقة) للمساعدة في توزيع المواد الغذائية داخل حبات الجينات ، والحد من التثاقل من الخرز. هذا مهم خصوصا ونحن ثقافة هذه غضروفية لفترة ممتدة من الزمن (تصل إلى 4 أسابيع). مذكرة: على الرغم من النمو خلية غضروفية وسائل الإعلام التمايز (Lonza) تحتوي على اثنين استخداما المضادات الحيوية والجنتاميسين الأمفوتريسين ، فإننا لم يكمل أي المضادات الحيوية عندما كنا مئوية مختلفة من السائل الزليلي لزراعة خلية غضروفية. ولوحظ عدم وجود تلوث من أي وقت مضى.
  4. تغيير وسائل الاعلام كل يوم مخاليط 2-3. وقد لزوجة السائل الزليلي عقبة رئيسية في زراعة غضروفية حبات مغلفة في الجينات خلال فترة طويلة الأجل الثقافات. وجدنا أنه الأكثر فاعلية لتخفيف السائل الزليلي ، تستكمل المتوسطة مع CaCl 102mM 2 (50 ٪ V / V) ، الذي يعزز أيضا سلامة من الخرز الجينات. في هذه الطريقة ، ببطء وسيلة يمكن إزالتها مع الماصة ، دون الإضرار الخرز.

4. متلازمة الطفل المفرط النشاط الحصاد في الخرز الجينات لتحليل التعبير الجيني

يجب توخي الحذر خاصة عند حصاد متلازمة الطفل المفرط النشاط من الخرز الجينات لتحليل التعبير الجيني.

  1. تغسل حبات ألجينات تي 3MES في CaCl 102 2 ملي لنحو 5 دقائق في كل مرة.
  2. استرداد غضروفية بإضافة 55 ملم على NaCitrate حجم 4-5 مرات من الخرز. فمن المهم أن يغرقها حبات الجينات في حل NaCitrate. اهتزاز أو الروك لمدة 20-30 دقيقة.
  3. تدور باستمرار تجاهل الخلايا وطاف.
  4. لRT - PCR التحليل ، resuspend الكرية خلية في المخزن تحلل الخلية (RNA Qiagen العزلة عدة) ، والمضي قدما في تنقية الحمض النووي الريبي.

5. متلازمة الطفل المفرط النشاط في الإصلاح الخرز الجينات لتحليل النسيجي

الرعاية الخاصة التي يجب اتخاذها لجني متلازمة الطفل المفرط النشاط من الخرز للتحليل النسيجي 3D.

  1. تغسل حبات ألجينات 3 مرات في 102 ملي CaCl 2 للمرة كل حوالي 5 دقائق. لغسل بعيدا تماما السائل اللزج الزليلي ، وجدنا أنها الأكثر فعالية لغسل المتوسطة مع تمايز خلية غضروفية (Lonza) بين عشية وضحاها ، التأرجح في الحاضنة 37 درجة مئوية تردد هزاز (: نحو 75 مرةق / دقيقة). تم استخدام متوسط ​​نمو خلية غضروفية لضمان بقاء خلية غضروفية في هذا يغسل طويلة والسماح للتغلغل الحد الأقصى للعامل اصلاح.
  2. إصلاح حبات في الايثانول 70 ٪ بين عشية وضحاها ، والمضي قدما في التحليل النسيجي. لأداء تلوين دابي ، احتضان حبات ألجينات مع الحل دابي (500ng/ml) ل1hr تحت هزاز لطيف ، ويغسل لمدة 3 مرات مع 102mM CaCl 2 لمدة 15 دقيقة كل مرة. ويمكن بعد ذلك أن ينظر إلى الصور دابي تحت المجهر الفلورسنت. يمكن أيضا أن يكون مقطوع الخرز الأزرق لalcian و H & E تلطيخ.

6. ممثل النتائج

ويصور لنا طريقة لزراعة 3D غضروفية الإنسان في نسب عالية من السائل الزليلي في الرسم التخطيطي هو مبين في Fig.1. بعد أن تم تغليف حبات غضروفية الإنسان في الجينات ، وسمح لهم تنمو في المتوسط ​​تستكمل مع تفاوت النسب من السائل الزليلي. بسبب لزوجة السائل الزليلي ، فمن الضروريغضروفية الثقافة في ظل ظروف هزاز ثابت لمنع تكتل ليبني الغضروف وضمان عدالة توزيع المواد الغذائية. ومن الضروري أيضا أن تغسل حبات الجينات على نطاق واسع قبل استرداد غضروفية ، بحيث تحدد أو تحلل العازلة يمكن ان تخترق الخرز (Fig.1). وتظهر مشرق الميدان (BF) صور غضروفية في الخرز ألجينات في Fig.2. تم تنفيذ تلوين دابي لتأكيد توزيع usniform من الخلايا داخل الخرز (الشكل 2). في نهاية الفترة الثقافة 21 يوما ، تم إجراء تحليل الجينات التعبير qRT - PCR. تم استخدام الجينات GAPDH مرجعية للتطبيع لجميع تقارير إتمام المشروعات ، كما تم تحديده ليكون واحدا من الجينات المرجعية الأكثر موثوقية لتحليل qPCR على غضروفية 32. ويرد مثال في الشكل. 3 ، حيث قمنا بتحليل النتائج من غضروفية مفصلي الإنسان المثقف في السائل الزليلي المجمعة من ستة مرضى هشاشة العظام. يتسق مع حقيقة أن من غضروفيةوجدنا وقد تم توسيع Lonza 2D في الثقافات ، والذي من شأنه أن يؤدي حتما إلى إلغاء التمايز 33 ، أن يوم 0 غضروفية أعرب مستويات أدنى من الجينات الغضروف مصفوفة (الشكل 3). زراعة 3D من غضروفية المتوسطة مع تمايز خلية غضروفية (Lonza) أو المتوسطة تستكمل مع السائل الزليلي زيادة كبيرة في التعبير الجيني للغضروف الكولاجين ، وaggrecan MMP13 ، الذي يشير إلى خلية غضروفية إعادة التمايز بحلول يوم 21 (Fig.3) 34. زيادة نسبة السائل الزليلي في وسائل الإعلام أدت إلى مستويات مماثلة من مصفوفة الغضروف الثاني الكولاجين وعلامات aggrecan التعبير مرنا (Fig.3A و3B). علاوة على ذلك ، غضروفية مثقف في السائل الزليلي 100 ٪ معارضها حتى انخفاضا في التعبير الغضروف انزيم المهينة مرنا MMP13 بالمقارنة مع أولئك المثقفين في حدها المتوسط ​​(Fig.3C). ومن المثير للاهتمام ، ومستوى التعبير عن موت الخلايا caspase المؤشر 3 انخفضت تدريجيا مع زيادة نسبة السائل الزليلي ، مما يوحي بأن لياليوقد أدى ynovial زراعة السائل إلى مستويات الخلايا انخفض (الشكل 3D). لذلك ، نتائجنا تظهر ان زراعة غضروفية مفصلي الإنسان في مستويات عالية من السائل الزليلي في وضع 3D هي التكنولوجيا ممكنا.

جداول وأرقام

الشكل 1.
الشكل 1. رسم تخطيطي لطريقة لغضروفية الثقافة مفصلي الإنسان في نسب عالية من السائل الزليلي في الخرز ألجينات 3D. أولا ، يتم خلط الجينات غضروفية والحل. عندما يطبق الانقطاع عن الحكمة في حل CaCl 2 ، وثبتوا غضروفية داخل حبات crosslinked هيدروجيل الكالسيوم وألجينات. ثم يتم تربيتها في هذه التركيبات 3D المتوسط ​​تمايز خلية غضروفية (Lonza) مع تفاوت النسب من السائل الزليلي الإنسان. بعد 21 يوما من زراعة تحت شرط هزاز ، تغسل حبات الجينات التي تحتوي على الخلايا على نطاق واسع بعد ذلك يتم استرجاع الخلايا للجيناتتحليل التعبير.

الشكل 2.
الشكل 2. مجال برايت (BF) والصور دابي لل chondrocytes مفصلي الثقافات البشرية مغلفة مع 0 ٪ ، 30 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ و 100 ٪ السائل الزليلي. وكانت غضروفية كروية الشكل في جميع الأحوال الثقافة. وكانت صور متراكبة من حقل مشرق (BF) ودابي لتأكيد الموقع وتوزيع غضروفية. Insets والصور المكبرة. النصال ، colocalization من غضروفية في BF والصور تلطيخ دابي.

الشكل 3.
الشكل 3. qRT - PCR تحليل مغلفة غضروفية مفصلي الإنسان في اليوم 0 (D0) بعد نهاية 21 يوما من زراعة (D21) في المتوسط ​​تستكمل مع نسب متفاوتة من السائل الزليلي (SF) (0 ٪ ، 30 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ و 100 ٪). وتظهر نتائج أربع عينات المستقلة هنا. كان يستخدم كمرجع GAPDH الداخلية لجميع تقارير إتمام المشروعات. باء. Aggrecan التعبير مرنا. C. MMP13 التعبير مرنا. D. Caspase التعبير مرنا 3. تم تقييم أهمية الإحصائية ليوم 0 عينات ونماذج من يوم 21 0 ٪ و 100 ٪ السائل الزليلي (SF) زراعة ، وذلك باستخدام برامج المعهد الوطني للإحصاء. * ترمز P <0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا التقرير ، طورنا أسلوب الذي يسمح لثقافة غضروفية مفصلي الإنسان في بيئة 3D في المتوسط ​​يحتوي على تركيزات عالية من السائل الزليلي الإنسان. السائل الزليلي هو واحد من العناصر الرئيسية التي تشكل البيئة الطبيعية في تجويف مشتركة ، حيث يقيم غضروفية مفصلي. ومع ذلك ، فقد كان لزوجة السائل الزليلي تحديا رئيسيا للزراعة على المدى الطويل ثلاثية الأبعاد من غضروفية. للتغلب على التحدي المتمثل في الحفاظ على توزيع المواد الغذائية حتى في بناء التجميع في بيئة لزجة ومنع 3D ، وضعنا تحت الغضروف يبني حركة مستمرة مع هزاز لطيف. لتعزيز السلامة الهيكلية للبنيات الغضروف ، نحن تعديل الإجراء التقليدي للغضروفية البذر إلى هيدروجيل الجينات بما في ذلك الاستفادة المثلى من طول الفترة الزمنية لتشكيل حبة وسائل الإعلام الداخلي التغير 31. مثل هذه الإجراءات ضرورية عنديتم التعامل مع بنيات الغضروف في السائل الزليلي للزج خلال فترة طويلة الأجل الثقافات.

ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب سوف تسمح لنا لدراسة بيولوجيا غضروفية مفصلي milleu الإنسان في وضعها الطبيعي ، السائل الزليلي. واحد قلق محتمل هو أن نشر كاشف قد لا تكون مثالية لغضروفية في تغليف حبات ألجينات ونمت في بيئة لزجة. وبالتالي لدراسة تأثير بعض المواد الكاشفة على الغضروف هندسيا ، قد تتحقق على نحو أفضل عن طريق الحد من انتشار حجم حبات الجينات ، وباستخدام نظم الارواء لتسهيل توزيع كاشف في السائل الزليلي. في حين تم الحصول على نتيجة من ممثلنا غضروفية استزراع الإنسان العادي في السائل الزليلي المستمدة من المرضى الذين يعانون من التهاب المفاصل ، ونحن نعتقد أنه يمكن استقراء هذا الأسلوب لاستخدام السائل الزليلي من شخص الأصحاء أو غيرها من الحيوانات الفقارية صحية. لأنه يمكن يرتبط نشاط السائل الزليلي إلى األنشطة اندماجيعلاقات كثيرة من العوامل البيوكيميائية موجودة في السائل ، قد تكون مرتبطة الأثر الصافي من السائل الزليلي على التعبير الجيني خلية غضروفية في نظامنا مع شدة المرض ، وسيساعد في نهاية المطاف علينا ان نفهم الوسط intraarticular قبل وبعد العلاج. وعلاوة على ذلك ، قد يؤدي أيضا لدينا وسيلة لإمكانية استخدام السائل الزليلي المريض الخاصة للاستزراع غضروفية ذاتي لتجديد الغضروف المفصلي والتي يتم تفصيلها بشكل فردي. تحقيقا لهذه الغاية ، وهذا قد يوفر النظام نظرة ثاقبة دراسة القوى التي تعمل من خلال النشاط الحيوي السائل الزليلي في الغضروف هندسيا الى 35 أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

نود أن نشكر روبن ناي (المركز الطبي لجامعة تافتس) ، ودانا اوشيمورا تومويا كيرنز (جامعة تافتس) لتقديم المساعدة في تخزين السائل الزليلي والطرد المركزي. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (1R01AR059106 - 01A1) لLZ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table of specific reagents and equipment:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments
Alginate (Alginic Acid sodium salt) Sigma-Aldrich A2158-250G 2.4% solution stored at 40°C
Calcium Chloride Dihydrate, Granular JT Baker A19339
Chondrogenic Growth media Lonza Inc. CC-3156 (base media)
CC-4409 (supplement)
Chondrogenic Differentiation Media Lonza Inc. CC-3226 (base media)
CC-4408 (supplement)
Human articular chondrocytes Lonza Inc. CC-2550
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma-Aldrich D9542
RNeasy mini kit (for RNA extraction) Qiagen 74104
PCR reagents: SYBR-green Quanta Biosciences 95053-500
12 ml syringe Tyco Healthcare, Covidien 512852
22-Gague Hypodermic Needle Tyco Healthcare, Covidien 8881
Microscope Olympus Corporation IX71
Platform rocker Thermo Fisher Scientific, Inc. Vari-mix
Collagen IIa-forward 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’
Collagen IIa-reverse 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’
MMP13-forward 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’
MMP13-reverse 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’
Caspase 3-forward 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’
Caspase 3-reverse 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
  2. Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
  3. Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
  4. Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
  5. Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
  6. Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
  7. Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
  8. Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
  9. Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
  10. Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
  11. van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
  12. Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
  13. Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
  14. Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
  15. Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
  16. Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
  17. Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
  18. Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
  19. Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
  20. Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
  21. Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
  22. Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
  23. Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
  24. Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
  25. Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
  26. Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
  27. van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
  28. Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
  29. Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
  30. Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
  31. Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
  32. Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
  33. Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
  34. Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
  35. Anat, J. 121, 107-118 (1976).

Tags

البيولوجيا الخلوية ، العدد 59 ، غضروفية ، مفصلي ، والبشرية ، السائل الزليلي ، ألجينات حبة ، والثقافة ، 3D
ونظام 3D لغضروفية التثقيف مفصلي الإنسان في السائل الزليلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brand, J. A., McAlindon, T. E.,… More

Brand, J. A., McAlindon, T. E., Zeng, L. A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid. J. Vis. Exp. (59), e3587, doi:10.3791/3587 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter